文献类型：学位论文

中文题名：当归红芪提取物对X线诱导乳鼠心肌成纤维细胞纤维化的相关机制及干预作用研究

作者：常娟[1];

第一作者：常娟

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：李应东;甘肃中医药大学|刘凯;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：当归红芪提取物;放射性心肌纤维化;TGF-β1/Smad3通路;细胞骨架;自噬

年份：2022

摘要：目的:探讨X线诱导Wistar乳鼠心肌纤维化的发生机制,阐明当归红芪提取物干预X线诱导大鼠心肌纤维化、超微结构的作用和潜在分子机制,及当归红芪提取物的多靶点、多通路干预效应,为当归红芪提取物治疗放射性心肌纤维化提供实验依据,为临床治疗放射性心肌纤维化提供新方法和新策略。方法:1.通过培养原代心肌成纤维细胞,建立X线诱导的心肌成纤维细胞纤维化的细胞模型,通过CCK-8法、免疫荧光染色、Western blot法检测相关蛋白,验证X线辐射后心肌成纤维细胞增殖、细胞凋亡及蛋白表达情况,并采用高通量转录组测序和分析。2.采用网络药理学和分子对接技术对当归、红芪活性成分、核心靶点、分子对接能力与放射性心肌纤维化疾病进行分析。3.通过不同剂量的当归红芪提取物干预X-ray辐照后心肌成纤维细胞,检测细胞增殖率和迁移率及Western blot蛋白表达;透射电镜观察心肌成纤维细胞中超微结构、细胞骨架结构免疫荧光的表达,观察当归红芪提取物对X线辐照后心肌成纤维细胞超微结构的作用。4.采用高通量转录组测序当归红芪提取物对X线诱导心肌成纤维细胞的作用,分析差异表达基因及富集通路,与之前实验进行比较分析。5.通过动物实验,采用HE和MASSON染色、免疫荧光鉴定、Western blot法检测当归红芪提取物对X线辐照后大鼠心脏纤维化的干预作用。结果:1.Wistar乳鼠原代心肌成纤维细胞由Vimentin蛋白鉴定,1Gy单一剂量的X射线辐照心肌成纤维细胞造模后,促进心肌成纤维细胞在48小时增殖（p＜0.05）;与对照组相比,模型组在X线辐射48小时后细胞凋亡率下降。心肌成纤维细胞中TGF-β1、α-SMA荧光染色定位表达显著;TGF-β1、Samd3、Col1蛋白表达显著升高（p＜0.05）。高通量转录组测序结果,差异表达m RNA为112个,主要包括线粒体内膜转移酶17b（Timm17b）、基底细胞粘附分子（Bcam）、线粒体核糖体蛋白（Mrpl30）、基质金属肽酶11（Mmp11）等。GO富集分析主要为四大类,包括与纤维化、炎症、自噬、细胞因子调控功能等。KEGG富集分析出24条通路,包括免疫应答过程、炎性反应、癌症通路等。2.经过网络药理学筛选出当归主要活性成分125个,红芪43个主要活性化合物,共同活性成分12个,当归、红芪的活性成分与放射性心肌纤维化相关联的核心蛋白靶点为28个,其中包括AKT、VEGFA、PIK3CA、MMP9等,涉及重要信号通路82条,主要包括癌症通路、PI3K/AKT信号通路等。采用分子对接技术将当归、红芪核心活性成分与关键靶点AKT、MMP9、MMP2、m TOR进行结合能力预测,结果发现槲皮素、美迪紫檀素、柚皮素、甘草素成分与AKT、MMP9、MMP2、m TOR有强烈的结合能力。3.采用当归红芪提取物组（高、中、低剂量组）干预X-ray辐射后心肌成纤维细胞。9μg/m L当归红芪提取物在48小时后降低细胞增殖（p＜0.01）,并且存在剂量依赖性,与对照组相比,模型组X-ray辐照后的心肌成纤维细胞伤口愈合率显著增快（p＜0.05）;与模型组相比,当归红芪提取物组中细胞伤口愈合率显著降低;与对照组相比,模型组中TGF-β1、Smad3、Col1的蛋白水平表达均升高;与模型组相比,当归红芪提取物组中TGF-β1、Smad3、Col1蛋白水平显著降低。透射电镜观察,对照组结果显示,细胞膜边缘完整并见伪足、自噬小体个别存在。与对照组比较,模型组中细胞整体水肿,线粒体数量较多,自噬溶酶体大量存在。与模型组对比,当归红芪提取物组中细胞整体呈中度水肿,细胞膜边缘大面积破损,线粒体减少,自噬溶酶体数量较少。对照组中心肌成纤维细胞微丝呈平行排列,整齐清晰;与对照组相比,模型组在X-ray辐照后,心肌成纤维体积变小,F-actin增粗;与模型组相比,当归红芪提取物组中心肌成纤维微丝排列呈现杂乱碎丝状,粘附力显著降低。4.高通量转录组测序当归红芪提取物干预X线辐射后的心肌成纤维细胞,对照组和模型组结果与实验一结果一致,模型组和当归红芪提取物组与对照组和当归红芪提取物组分析后发现,转录组基因表达与整合素、细胞骨架（微管、中间丝）、线粒体、溶酶体关系密切,对于细胞骨架的调控、整合素的正负调控、线粒体和溶酶体功能等都有干预作用。而在模型组和当归红芪提取物组与对照组和当归红芪提取物组的富集通路中癌症通路和PI3K/AKT通路均占比重最高,此结果与实验二结果一致。5.以8Gy X-ray为建立Wistar大鼠放射性心肌纤维化的辐射剂量,给予50mg/kg/day剂量的当归红芪提取物干预放射后大鼠心肌纤维化。在HE染色中,与对照组相比,模型组在X-ray辐照后出现心肌炎性渗出较明显;与模型组相比,当归红芪提取物组中心肌中炎性物质渗出减少。Masson染色结果,与对照组相比,模型组中的心肌组织纹理排列紊乱无序,胶原增多成纤维化表现;与模型组相比,当归红芪提取物组中的心肌组织纹理相对整齐。当归红芪提取物降低X线辐射后大鼠心脏中TGF-β1、Smad3、Col1的荧光表达。与对照组相比,模型组中X-ray辐射大鼠心脏后蛋白TGF-β1、PI3K、AKT表达均升高,与模型组相比较,当归红芪提取物组中TGF-β1、PI3K、AKT表达显著降低（p＜0.05）。结论:当归红芪提取物可以缓解X线诱导TGF-β1/Smad3通路促进放射性心肌纤维化,并可能通过PI3K/AKT通路调控自噬过程,对X线辐射后心肌成纤维细胞的骨架和超微结构具有调节作用,对于大鼠X线辐射后心脏的损伤具有缓解纤维化的作用。