文献类型：学位论文

中文题名：细胞因子修饰的MSCs联合红景天促进脊髓损伤修复的实验研究

作者：王博[1];

第一作者：王博

机构：[1]甘肃中医学院;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：哈小琴;甘肃中医学院

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：高海拔;脊髓损伤;红景天;间充质干细胞;角质生长因子;低氧诱导因子;细胞移植;腺病毒

年份：2014

摘要：目的：在低氧环境下，对雌性大鼠脊髓撞击损伤模型，用中药红景天联合应用角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)和低氧诱导因子-1(hypoxia induciblefactor-1，HIF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(marrow-mesenchymal stem cells， MSCs)进行防治，动态评估脊髓损伤修复愈合的速度、质量及功能重建情况，将为低氧环境下脊髓再生修复及功能重建提供新的治疗策略。 方法： (1)雄性大鼠MSCs的分离、培养及鉴定，选用CD34、CD45、CD90、CD105抗体进行骨髓间充质干细胞的鉴定。(2)MSCs外源基因的修饰，MSCs分别用200MOI的Ad-KGF-HIF、Ad-KGF、Ad-HIF感染MSCs，72h收集细胞备用。(3)大鼠脊髓损伤模型建立，应用Allen打击法致雌性Wistar大鼠脊髓损伤，创建脊髓撞击损伤模型。(4)细胞移植及红景天的应用，模型大鼠分为7组：生理盐水对照组(a)、红景天组(b)、MSCs移植组(c)、Ad-HIF修饰的MSCs移植组(d)、Ad-KGF修饰的MSCs移植组(e)、Ad-KGF-HIF修饰的MSCs移植组(f)、中药红景天联合Ad-KGF-HIF修饰的MSCs组(g)。(5)组织学观察及功能评估， HE染色观察脊髓出血、水肿;神经尼氏体亚甲蓝染色观察神经细胞肿胀、变性、坏死变化;免疫组织化学法检测KGF和HIF蛋白的表达;功能评估标准采用改良Gale联合评分法(改良CBS法)进行评分。(6)RT-PCR法检测腺病毒及性别决定基因sry的表达丰度，以评价移植病毒的生物分布及移植细胞参与修复组织的量;原位杂交法检测Sry基因的分布定位，以确定MSCs细胞移植成功。 结果： 1、雄性大鼠MSCs的分离、培养后鉴定：结果CD105和CD90两种表面分子表达呈阳性，CD34和CD45两种表面分子表达呈阴性;2、Ad-KGF-HIF、Ad-KGF、Ad-HIF感染MSCs修饰后，ELISA法检测到细胞中两种外源基因的表达，且两种细胞因子的表达上清可刺激低氧条件下培养的成骨细胞增殖;3、用Allenˊs打击法成功建立了雌性Wistar大鼠脊髓损伤模型;4、细胞移植及红景天应用后，组织学观察结果：HE染色，3周a组、b组、c组有较多空腔且无明显变化， d组、e组空腔减少未见新生组织，f组、g组的空腔有较多新生组织，12周a组、b组仍有较多空腔，神经纤维及细胞坏死，在横断处附近形成较多空泡，f组、g组无明显空腔，空泡小而少。神经尼氏体亚甲蓝染色，1-12周，a组、b组神经细胞损伤最严重且修复很少c组d组、e组神经有修复但不明显，f组、g组神经细胞逐渐修复，神经细胞数量增多。术后1周、3周、6周、12周评估功能指标，c组、d组、e组、f组、g组运动功能均优于红景天组与对照组，其中g组较为明显;5、sry基因：RT-PCR法检测sry基因，移细胞移植组sry基因检测量均较高。原位杂交检测sry基因的移植后脊髓组织中的表达量，细胞移植组均表达，g组表达量高于其它组移植细胞的监测。 结论： 1、密度梯度离心法成功分离MSCs，重组腺病毒感染后可成功表达具有生物活性的HIF和KGF两种外源基因;2、成功建立了脊髓损伤模型;3、初步验证了在低氧环境下大鼠脊髓损伤模型中，HIF和KGF双基因修饰的大鼠MSCs联合红景天的防治方案对于促进脊髓损伤的修复具有较好的效果;4、检测到HIF和KGF基因在局部有表达，在损伤修复组织检测到移植细胞的存在，表明转入的基因及细胞均参与了脊髓损伤的修复