文献类型：学位论文

中文题名：当归醇提物对SHR血压及靶器官的影响及分子机制探讨

作者：魏惠平[1];

第一作者：魏惠平

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：李应东;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：原发性高血压;当归醇提物;血压水平;靶器官;实验药理

年份：2020

摘要：目的：　　1.明确当归醇提物对SHR血压和靶器官的作用。　　2.基于Th17/Treg细胞平衡探讨当归醇提物干预SHR血压和靶器官损伤的分子机制。　　方法：　　1.系统检索Cochrane、Web of science、PubMed、Embase、中国知网、万方、CBM七个数据库，纳入当归和含有当归的复方制剂治疗高血压及其并发症的相关研究。使用EXCEL2013和SPSS21对数据进行整合与处理，并通过气泡图来呈现结果。　　2.结合70%乙醇热回流法和喷雾干燥法制备当归有机酸;建立高效液相色谱法测定当归醇提物中阿魏酸含量的方法，通过阿魏酸含量控制当归醇提物的质量。　　3.动物分组：空白组9只WKY大鼠，模型组、阳性对照组（贝那普利）、当归醇提物低、中、高剂量组各9只SHR大鼠。空白组和模型组用等体积生理盐水，阳性对照组用贝那普利片10mg/d，当归醇提物低、中、高剂量组分别用对应剂量，进行灌胃，每日1次，连续8周。监测各组大鼠血压及其他生理参数;通过大鼠心脏彩超、HE染色、Masson染色评估心脏形态结构和功能;采用ELISA、Western Blot、RT-PCR实验方法检测血清中NF-κβ、VCAM-1、ET-1、ICAM-1、eNOS含量，并基于蛋白-基因层面监测RAAS系统和氧化应激成分的表达;评价当归醇取物对SHR肝肾功能的影响。　　4.基于网络药理学筛选当归治疗高血压及靶器官保护的信号通路。　　5.建立SHR模型，随机分为模型组、贝那普利组、当归醇提物高剂量组，并设空白组（WKY）。ELISA法检测血清炎症指标IL-6、CRP以及Th17、Treg表达因子IL-17、IL-23、IL-10、TGFβ1含量;流式细胞技术检测外周血中Th17、Treg细胞，并计算Th17/Treg比率;qPCR检测大鼠肾组织转录因子FoxP3和RORγt的表达;Western Blot检测大鼠肾组织p38、p-p38、FoxO1、p-FoxO1、SGK1和IL-23R表达。　　结果：　　1.Evidence Mapping　　分析纳入的RCT研究，总有效性结局指标占69.4%，有效率与对照组相比具有统计学差异;纳入研究干预措施中所用的中药药性将其分为补气活血法、补气养血法、补气养阴活血法等八大类，大部分药性类型为活血化瘀方;纳入文献中治疗组与对照组在降压、靶器官保护，不良反应等方面具有统计学差异。　　2.当归醇提物的制备及质量控制　　当归醇提物呈棕褐色细粉。高效液相色谱条件为C18色谱柱，流动相由乙腈-0.1%磷酸溶液组成，梯度洗脱，洗脱时间为：0-30min，A：95%-5%(v/v)，B：5%-95%(v/v);检测波长为316nm;该方法专属性强，精密度，回收率能满足体外分析要求;当归醇提物中阿魏酸平均含量为(151.525±0.002)%（μg/g）。　　3.当归醇提物对SHR的降压效果评价指标及肝肾功能影响　　血压及一般状况：给药2、4、6、8周后，贝那普利组、当归醇提物高剂量组收缩压和舒张压均低于模型组（P＜0.01）。　　与模型组相比，贝那普利组与当归醇提物中、高剂量组大鼠活动积极，反应灵敏，睡眠少、体毛光泽，弓背表现少，体重升高。　　心脏形态结构和功能：①彩超：与空白组相比，模型组大鼠心脏LVEDD、LVESD减小，IVSTD及LVPWTD均明显增厚，EF、FS、E/A降低（P＜0.05）。与模型组相比，贝那普利组LVEDD、LVESD增加，EF、FS、E/A提高，IVSTD、LVPWTD降低，高剂量当归醇提物明显增了LVEDD、LVESD、EF、FS、E/A，差异具有统计学意义（P＜0.05）。②HE染色：与空白组比较，模型组SHR心肌细胞体积增大、心肌纤维走形紊乱、细胞核染色加深、细胞间隙增大伴明显的组织胶原沉积及炎症细胞浸润;与模型组相比，贝那普利组及当归醇提物高剂量组SHR心肌纤维走形整齐、细胞核染色正常，未见明显的炎症细胞浸润及细胞间质胶原沉积。③Masson染色显示：与空白组比较，模型组心肌组织间隙可见大量胶原纤维沉积、细胞间隙增宽、心肌细胞形态受压失去原有的梭形结构、血管周围大量的胶原沉积;与模型组比较，贝那普利及当归醇提物高剂量组心肌纤维间隙、血管周围胶原沉积明显减少、心肌细胞梭形结构清晰可见。　　血管内皮功能及RAAS系统指标：①与空白组比较，模型组大鼠VCAM-1、ET-1、ICAM-1蛋SHR白表达上升，基因表达明显上调，氧化应激因子eNOS蛋白表达下降，基因表达明显下调（P＜0.01）;与模型组比较，贝那普利组及当归醇提物高剂量组VCAM-1、ET-1、ICAM-1蛋白表达下降，基因表达下调，而eNOS蛋白表达升高，基因表达上调（P＜0.01）。②与空白组比较，模型组大鼠AT1-R蛋白表达升高，基因表达上调，AT2-R蛋白表达下降，基因表达下调（P＜0.05）;与模型组比较，贝那普利组及当归醇提物组AT1-R蛋白表达下降，基因的表达下调，AT2-R蛋白表达升高，基因表达上调（P＜0.05）。　　肝肾功能影响的初步评价：与空白组比较，实验各组大鼠血清生化指标ALT、AST、BUN、CREA均在同一水平，无统计学差异（P＞0.05）。　　4.网络药理学探讨当归防治高血压的机制研究　　当归治疗高血压时主要涉及生物膜合成、脑肠轴发育、细胞内钙信号转导、平滑肌收缩、刺激cAMP合成、脂多糖反应、G蛋白耦连的信号转导等生物过程;MAPK/SGK1/FoxO1/RORγt/IL-23R信号通路可能通过调节Th17/Treg细胞的平衡发挥降低SHR模型血压及靶器官保护的作用。　　5.当归醇提物干预SHR血压和靶器官损伤的作用机制　　肾脏组织病理：与空白组比较，SHR模型组大鼠肾小球纤维化明显，肾小管上皮细胞肿胀，管腔变窄，肾小管周围的毛细血管受压，形态欠规则，间质肿胀，炎性细胞浸润;与模型组比较，贝那普利组、当归醇提物高剂量组大鼠肾小球纤维化减轻，肾小管形态规则，炎性浸润减少。　　血清炎症指标：①与模型组比较，贝那普利组、当归醇提物高剂量组IL-6、CRP的表达降低（P＜0.05）。②与空白组比较，模型组大鼠Th17细胞百分比上升，Treg细胞百分比明显下降，Th17/Treg细胞比值上升;与模型组大鼠比较，贝那普利组、当归醇提物高剂量组Th17细胞百分比下降，Treg细胞百分比上升，Th17/Treg细胞比值明显下降（P＜0.05）。③与模型组比较，贝那普利组、当归醇提物高剂量组IL-17、IL-23均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。④与模型组比较，贝那普利组、当归醇提物高剂量组IL-10、TGFβ1均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　RORγt、FoxP3的表达：①与空白组相比，模型组RORγt表达降低（P＜0.05）;贝那普利组、当归醇提物高剂量组RORγt表达均低于模型组（P＜0.05）。②与空白组相比，模型组Fox P3表达升高（P＜0.05）;贝那普利组、当归醇提物高剂量组Fox P3表达均升高于模型组（P＜0.05）。　　p38/MAPK通路相关因子的表达：与空白组比较，模型组SHR肾脏组织中p-p38、SGK1、p-FoxO1和IL-23R的表达水平升高（P＜0.05）;与模型组相比，贝那普利组、当归醇提物高剂量组大鼠肾脏组织中p-p38、SGK1、p-FoxO1和IL-23R的表达水平降低（P＜0.05）。　　结论：　　1.目前的研究现状提示当归对高血压治疗的降压及靶器官保护有效且不良反应较低，但其疗效有待更多的研究进一步证明。　　2.当归醇提物可以改善SHR一般情况，一定程度上降低SHR血压，能够逆转SHR心肌重塑、改善内皮功能，且无明显肝、肾功能影响。　　3.Th17/Treg平衡失调是SHR模型高血压发病的关键因素，当归醇提物高剂量组通过调节p38MAPK/SGK1/FoxO1/RORγt/IL-23R介导的Th17/Treg平衡，降低SHR血压，防治其靶器官损伤。