文献类型：学位论文

中文题名：AZT协同As2O3通过靶向Wnt/β-catenin通路和DNMTs抗肝癌的作用机制研究

作者：高娜[1];

第一作者：高娜

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：陈彻;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：三氧化二砷;3'-叠氮化物-3'-脱氧胸腺嘧啶;肝细胞癌;DNA甲基转移酶3b;Wnt/β-catenin信号通路

年份：2023

摘要：目的:阐明3'-叠氮化物-3'-脱氧胸腺嘧啶（3'-azide-3'-deoxythymine,AZT）协同三氧化二砷（Arsenic trioxide,AsO,ATO）是否通过靶向DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）影响Wnt/β-catenin信号通路调控肝细胞癌细胞的增殖凋亡。为临床治疗肝细胞癌寻找新的去甲基化药物提供理论依据。方法:（1）通过癌症基因图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）、基因表达谱交互分析数据库（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）、PCViz数据库分析DNMT3b在肝细胞癌中的表达情况及相关性。利用UALCAN数据库分析SFRP2启动子区域甲基化水平。（2）CCK8法检测Hep G2、MHCC97-H细胞在AsO（2μmol/L）、AZT（20μmol/L）和两药联合干预后,24h、48h、72h的细胞增殖率。（3）常规方法培养人肝癌Hep G2、MHCC97-H细胞,用AsO（2μmol/L）和AZT（20μmol/L）分别单独和联合处理肝癌细胞72h,采用定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测DNMT3b和分泌卷曲蛋白2（secreted frizzled-related proteins,SFRP2）的m RNA表达情况。Western blotting法检测β-catenin、DNMT3b、SFRP2蛋白表达情况。（4）采用甲基化特异性PCR（Methylation specificity PCR,MSP）技术检测对照组和实验组SFRP2启动子区Cp G岛甲基化水平的变化,分析SFRP2启动子区甲基化情况,探讨AsO联合AZT治疗HCC的DNA甲基化变化。（5）用过表达载体转染DNMT3b后,用AsO和AZT联合处理肝癌细胞,通过RT-q PCR和Western blotting实验检测β-catenin和SFRP2的表达情况,分析AZT协同AsO通过靶向DNMT3b阻断Wnt/β-catenin通路抗肝癌。结果:（1）生信分析发现在肝细胞癌中DNMT3b表达上调,且DNMT3b与β-catenin有相关性。另外UALCAN数据分析SFRP2启动子区域的甲基化程度在HCC组织中显著升高（P<0.05）。（2）CCK8实验结果表明,在同一时间点,两药联合干预组能够在不同程度上抑制肝癌细胞增殖,在72h时差异显著,具有统计学意义（P<0.0001）。在AsO（2μmol/L）和AZT（20μmol/L）联合用药作用下,随着干预时间的延长,在72h时肝癌细胞增殖率下降最显著,且差异具有统计学意义（P<0.0001）。（3）MSP实验结果表明,经过联合药物干预后,Hep G2、MHCC97-H细胞中发生了明显得SFRP2去甲基化,提示AZT联合AsO能够降低肝癌细胞中SFRP2启动子的甲基化水平。（4）RT-q PCR法和蛋白印迹法检测AsO（2μmol/L）、AZT（20μmol/L）和联合药物处理后DNMT3b m RNA和蛋白的表达水平明显低于空白组（P<0.01）,SFRP2 m RNA和蛋白的表达水平明显高于空白组（P<0.01）,β-catenin蛋白水平明显低于空白组（P<0.001）。（5）转染DNMT3b之后,联合用药干预后mimic-DNMT3b组和NC组相比,SFRP2基因和蛋白表达水平显著下降（P<0.001）,β-catenin蛋白水平显著升高（P<0.001）。结论（1）AZT协同AsO可以影响SFRP2 DNA甲基化水平的变化。（2）AZT协同AsO通过靶向DNMT3b阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞增殖。