文献类型：学位论文

中文题名：基于PI3K/AKT通路介导氧化应激损伤探讨党参水提物对溃疡性结肠炎肠黏膜的保护机制研究

作者：李芳[1];

第一作者：李芳

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：杨扶德;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：党参;溃疡性结肠炎;PI3K/AKT;代谢组学;转录组学;网络药理学

年份：2023

摘要：以甘肃道地药材党参为研究对象,运用网络药理学及分子对接探究党参干预溃疡性结肠炎(UC)的潜在机制;通过建立2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇诱导UC大鼠模型,以氧化应激肠黏膜损伤为着眼点,运用代谢组学-网络药理学联合分析探究党参水提物(CPAE)调控结肠黏膜差异代谢物干预UC的作用机制;运用转录组学探究CPAE调控结肠黏膜差异基因干预UC的作用机制;运用动物实验探究CPAE基于PI3K/AKT调控下游信号通路改善UC结肠黏膜组织缺氧,黏膜细胞铁死亡及能量代谢异常等氧化应激损伤的作用机制。综合分析党参“多点显效,协同增效”多维度干预UC模型大鼠肠黏膜氧化应激损伤的特点;探讨党参治疗UC的作用机制,为进一步发掘党参的潜在应用价值提供参考。1 CPAE干预UC的药效学研究建立UC大鼠模型,随机分为模型(Model)组,柳氮磺吡啶(SASP,0.3g·kg)组,CPAE低剂量(DSL,4.5g·kg)组,CPAE中剂量(DSM,9g·kg)组,CPAE高剂量(DSH,18g·kg)组及铁抑制剂(anti-Fe,0.8mg·kg)组,各组大鼠灌胃给药,1次/d,连续7d,每日记录大鼠摄食、排便、毛色、体重及精神状况等体征,进行DAI评分;计算结肠指数,结肠黏膜HE染色观察及TDI评分,电镜观察结肠黏膜病理损伤情况。ELISA法检测血清炎症因子IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17,TNF-α,NF-κB,CRP,INOS,PCT,D-LA;生化法检测血清GSH,MDA含量及SOD活性,检测结肠黏膜MPO含量;UHPLC-QE-MS法检测CPAE主要成分进行CPAE受试物质控。结果显示,CPAE中含有2-Ketobutyric acid,3’,4’,7-Trihydroxyisoflavone,4-Hydroxybenzaldehyde,5-Hydroxy-6,7-dimethoxyflavone,9Z,11E-Linoleic acid等化学成分。CPAE可增加UC模型大鼠体重,改善血便、水样便情况,降低DAI评分;也可改善结肠黏膜充血水肿,减轻炎症细胞浸润,降低TDI评分从而保护结肠黏膜细胞形态结构。CPAE可提高大鼠血清GSH水平及SOD活力,降低IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17,TNF-α,NF-κB,CRP,PCT,INOS,D-LA,MDA水平及结肠黏膜MPO含量。结果表明CPAE对UC的治疗作用可能与抑制炎症细胞因子抗氧化应激有关。2网络药理学探讨党参治疗UC的潜在机制运用TCMSP,Gene Card,DisGeNET,String等数据库挖掘筛选党参潜在活性成分及疾病靶点,构建PPI网络;网络拓扑分析筛选药物-疾病核心靶点并进行GO和KEGG富集分析;分子对接预测中药党参干预UC成分靶点结合稳定性。结果显示,党参化学成分134个,活性成分21个,治疗UC靶点73个,关键靶点37个;GO分析及KEGG信号通路富集分析获得党参治疗UC的潜在靶点包括AKT,IL-6,VEGF,EGFR等37个,调节PI3K/AKT,IL-17等分子信号通路是党参治疗UC的潜在机制。分子对接显示党参活性成分与潜在靶点结合稳定。结果表明PI3K/AKT是党参治疗UC的潜在核心机制。3代谢组学探究CPAE干预UC的机制运用代谢组学方法对Control组,Model组及DSH组结肠黏膜组织样本进行代谢物检测鉴定,结合PCA,OPLS-DA筛选代谢差异物,GO分析及KEGG富集显著差异代谢物及相关代谢通路。将差异代谢物通过数据库映射寻找关键靶点,与网络药理学预测到的核心靶点进行互联分析,探索关联的生物信息学过程及信号通路。结果显示,UPLC-MS/MS正离子模式下共鉴定出4831个代谢产物,负离子模式下鉴定出4787个代谢产物,正离子模式下分离效果更佳,PCA,OPLS-DA分析显示质控效果良好。Control组与Model组比较共筛选出差异代谢物134个,其中上调93个,下调41个;DSH组与Model组比较共筛选出差异代谢物83个,其中上调30个,下调53个;代谢产物通路富集分析发现CPAE通过调节嘌呤代谢,甘油磷脂代谢,花生四烯酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,酪氨酸代谢通路,干预UC疾病。代谢差异物关联靶点与网络药理学潜在靶点最终富集于PI3K/AKT等信号通路。结果表明PI3K/AKT是CPAE调控差异代谢物治疗UC的关键信号通路。4转录组学探究CPAE干预UC的机制运用转录组学方法对Control组,Model组及DSH组结肠黏膜组织样本进行Total RNA提取与质检,序列分析文库的构建与评价,RNA-seq样品测序与筛选分析,参考序列比对分析,基因表达水平分析,基因表达差异分析等数据处理和筛选,获得差异基因,GO分析及KEGG富集分析显著表达信号通路。qRT-PCR定量分析显著差异基因的表达情况。结果显示,Control组与Model组比较共筛选出4727个差异基因,其中上调基因2157个,下调基因2570个;DSH组与Model组比较共筛选出1058个差异基因,其中上调基因669个,下调基因389个。PCA分析显示各组之间明显分离。KEGG富集分析结果显示,Model组与Control组差异基因富集于331个KEGG通路,显著富集于PI3K/AKT,NF-Kappa B等145条通路;DSH组与Model组差异基因富集于279个KEGG通路,显著富集于PI3K/AKT,PPAR等59条信号通路。Col4a6,Lama2,Ngfr,Lamc3,Lamb2,Itga7,Lpar3,Efnα1,Prlr,Pdpk1,Ccnd2等是富集于PI3K/AKT信号通路的显著差异基因;qRT-PCR结果显示经CPAE干预后,上述显著差异基因反向调控趋势明显。结果表明PI3K/AKT是CPAE调控差异基因治疗UC的显著表达信号通路;Col4a6,Lama2,Ngfr,Lamc3,Lamb2,Itga7,Lpar3,Efnα1,Prlr,Pdpk1,Ccnd2是参与PI3K/AKT信号通路调控的显著表达差异基因。5基于PI3K/AKT研究CPAE干预UC肠黏膜氧化应激损伤的机制检测UC模型大鼠血清Fe含量;ELISA法检测血清GPX4,EPO,HIF-1α含量;磷钼酸比色法测定UC模型大鼠结肠黏膜组织ATP含量;生化法检测结肠黏膜组织ATPase,Na-K-ATPase,Ca-Mg-ATPase含量并计算相关活力酶活力度;WB检测结肠黏膜组织PI3K,AKT,p-PI3K,p-AKT,SIRT1,PGC-1α,FTH1,GPX4,Keap1,Nrf2,HIF-1α,VEGF,DRP1和MIRO的蛋白表达;qRT-PCR检测结肠黏膜PI3K,AKT,SIRT1,PGC-1α,FTH1,GPX4,Keap1,Nrf2,HIF-1α和VEGF的mRNA基因表达。结果显示,CPAE组血清Fe,HIF-1α,EPO含量降低,GPX4含量升高;结肠黏膜组织ATP含量升高,ATPase,Ca-Mg-ATPase,Na-K-ATPase活力不同程度增加;PI3K,P-PI3K,AKT,P-AKT,Keap1,DRP1,MIRO,HIF-1α,VEGF蛋白表达不同程度降低,Nrf2,FTH1,SIRT1,PGC-1α,GPX4蛋白表达不同程度升高;PI3K,AKT,Keap1,HIF-1α,VEGF基因表达不同程度降低,Nrf2,FTH1,SIRT1,PGC-1αmRNA基因表达不同程度升高。结果表明基于PI3K/AKT调控Keap1/Nrf2,HIF-1α/VEGF,SIRT1/PGC-1α是CPAE改善UC结肠黏膜缺氧,能量代谢异常及黏膜细胞铁死亡等UC氧化应激损伤的可能机制。综上,PI3K/AKT信号通路是UC发生的核心机制,CPAE可能是基于调控差异代谢物及差异基因调控PI3K/AKT表达抑制下游氧化应激,从而改善结肠粘膜缺氧,修复能量代谢受损,延缓黏膜细胞铁依赖性死亡,从而提高结肠黏膜抗氧化能力,发挥对UC结肠黏膜的保护作用。