文献类型：学位论文

中文题名：血清外泌体通过LOX-1/TRAF6/NF-κB信号通路调控高糖干预下破骨细胞骨吸收功能

作者：司惠玲[1];

第一作者：司惠玲

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：刘静;甘肃中医药大学|张琦;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：LOX-1;糖尿病性骨质疏松;破骨细胞;血清外泌体;骨吸收

年份：2023

摘要：目的:本研究主要探讨高糖状态下血清外泌体通过凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)/肿瘤坏死相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)/核因子κB(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,NF-κB)信号途径调控破骨细胞骨吸收功能及相关因子变化的分子机制,旨在阐明糖尿病性骨质疏松(Diabetic osteoporosis,DOP)的病理机制及为寻找治疗糖尿病性骨质疏松的靶向药物提供新思路。方法:体外从C57BL/6小鼠中分离提取骨髓巨噬细胞,诱导分化成破骨细胞,进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定,用DMEM高糖培养基培养破骨细胞;采用Exo Quick 外泌体提取试剂盒,从健康人体的血清中提取外泌体,用透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)进行形态学特征观察和纳米颗粒追踪分析技术(Nanosight,NTA)进行颗粒浓度分布分析,并用新鲜提取的血清外泌体干预破骨细胞;构建慢病毒LOX-1沉默载体(lentiviral silencing vector,LV-LOX-1)和慢病毒空载体(lentiviral control vector,LV-CON)对破骨细胞进行转染;实验分组为:对照组(NC组)、高糖组(HG组)、慢病毒LOX-1沉默组(LV-LOX-1组)和慢病毒空载体组(LV-CON组);分别使用TRAF-STOP 6877002(TRAF6抑制剂)和BAY11-7082(NF-κB抑制剂)处理破骨细胞,采用CCK-8法检测破骨细胞活力。采用qRT-PCR和Western blotting技术检测破骨细胞中LOX-1、TRAF6、NF-κB、基质金属酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9),抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)的mRNA和蛋白的表达水平。结果:1.TRAP染色结果显示:在倒置相差显微镜下可观察到破骨细胞体积较大,形态多样,边缘有褶皱,周围可见血清外泌体大量伪足,大多数破骨细胞被染成强蓝色斑点并可见≥3个细胞核。2.TEM结果显示:大部分血清外泌体颗粒呈圆形囊泡状,直径约为100 nm。3.NTA结果显示:提取出的血清外泌体颗粒直径大多在30～150 nm之间,其中74.75nm分布最多,浓度为3.34E+9粒/ml。4.HG组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平增加。与NC组相比,HG组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP中mRNA表达水平分别增加了134.46%、100.60%和136.36%,蛋白表达水平分别增加了49.47%、59.35%和44.18%,差异具有统计学意义(P<0.01)。5.HG+LV-LOX-1组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平降低,与HG+LV-CON组相比,HG+LV-LOX-1组细胞LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了27.47%、25.62%和29.40%,蛋白表达水平分别降低了19.10%、23.78%和23.56%,差异具有统计学意义(P<0.01)。6.EXOs组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平降低,与NC组相比,NC+EXOs组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了45.14%、47.18%、46.11%,蛋白表达水平分别降低了40.98%、49.25%、43.31%,差异具有统计学意义(P<0.01);与HG组相比,HG+EXOs组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了53.61%、54.63%、60.37%,蛋白表达水平分别降低了49.19%、50.37%、72.52%,差异具有统计学意义(P<0.01);7.HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP 6877002组和HG+LV-LOX-1+BAY11-7082组细胞中TRAF6、NF-κB、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白表达水平降低。与HG+LV-LOX-1组相比,HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP 6877002组细胞中TRAF6、NF-κB、MMP-9和TRAP,mRNA表达水平分别降低了55.79%、38.46%、37.27%,40.69%,蛋白表达水平分别降低了36.89%、19.92%、38.74%、32.38%,差异具有统计学意义(P<0.01)。与HG+LV-LOX-1组相比,HG+LV-LOX-1+BAY11-7082组细胞中NF-κB、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了53.17%、54.75%、52.16%,蛋白表达水平分别降低了34.52%、48.91%、46.62%,差异具有统计学意义(P<0.01);8.HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP6877002+EXOs组和HG+LV-LOX-1+BAY11-7082+EXOs组细胞中MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平降低。与HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP6877002组相比,HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP 6877002+EXOs组细胞中M MP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了27.56%、18.16%,蛋白水平分别降低了11.76%、16.42%(P<0.01);与HG+LV-LOX-1+BAY11-7082组相比,HG+LV-LOX-1+BAY11-7082+EXOs组细胞中MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了30.42%、22.28%,蛋白表达水平分别降低了17.25%、14.13%(P<0.01)。结论:高糖干预下,破骨细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的表达水平上调,而慢病毒LOX-1沉默后可逆转上述现象,抑制破骨细胞骨吸收功能;血清外泌体通过LOX-1/TRAF6/NF-κB通路抑制高糖干预的破骨细胞的MMP-9和TRAP的表达水平,改善破骨细胞骨吸收功能障碍,进而延缓DOP的进展。