文献类型：学位论文

中文题名：盐酸去氢骆驼蓬碱对黑色素瘤B16F10抗瘤作用的研究

作者：张璐[1];

第一作者：张璐

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：呼永华;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：盐酸去氢骆驼蓬碱;恶性黑色素瘤;细胞凋亡;RNA-Seq

年份：2022

摘要：目的:探讨盐酸去氢骆驼蓬碱(Harmine Hydrochloride)对恶性黑色素瘤细胞(B16F10)抗瘤作用及基于高通量转录组测序技术(RNA-seq)的RNA表达差异研究,以证实盐酸去氢骆驼蓬碱对恶性黑色素瘤细胞的抗瘤作用,寻求与HIF-1α相关的作用靶点和探讨可能的抗瘤作用机制。方法:使用CCK-8细胞增殖-毒性实验测定盐酸去氢骆驼蓬碱对B16F10细胞抑制率的影响;利用流式细胞仪测定药物干预后的B16F10细胞周期的分布、细胞凋亡率及细胞内活性氧含量;采用Hoechst和MDC染色测定干预后B16F10细胞是否发生细胞程序性死亡;透射电子显微镜检测细胞内超微结构的变化;使用Transwell及划痕实验检测药物对B16F10细胞侵袭及迁移的影响;RNA-Seq分析药物干预后B16F10细胞差异RNA表达的情况;用Western Blot对部分差异表达的RNA(HIF-1α、angpt-2、NNT)在蛋白层面进行验证。结果:1.CCK-8检测结果表明,当盐酸去氢骆驼蓬碱的药物浓度范围在20-640μM时,细胞的抑制率逐步上升,最高可达87.67±0.58%(P<0.05)。流式细胞术细胞周期检测和克隆形成实验结果表明,盐酸去氢骆驼碱抑制B16F10细胞集落的形成(P<0.05),同时又改变B16F10细胞周期的分布,其中G2/M期B16F10细胞内DNA含量从8.04±0.66%升高至74.95±6.69%(P<0.05)。2.普通光学显微镜实验结果表明,盐酸去氢骆驼蓬碱使B16F10细胞体积增大、数目减少,同时,形态从长梭形变成不规则的多边形或近似圆球形。Hoechst以及MDC染色实验结果显示,盐酸去氢骆驼蓬碱能够诱导B16F10细胞出现凋亡小体及自噬小体;透射电镜结果表明,盐酸去氢骆驼蓬碱干预后的B16F10细胞内线粒体由泡状圆形缩小成椭圆形,线粒体嵴由断裂稀松变为排列整齐、紧密,且数目增多,同时,细胞质内出现凋亡小体和自噬小体;流式细胞仪检测细胞凋亡和ROS结果分别显示,500μM的盐酸去氢骆驼蓬碱作用B16F10细胞48h后,细胞的总凋亡率达到了45.84±5.52%(P<0.01),细胞内ROS的含量达到21.60±8.2%(P<0.05)。3.Transwell实验与划痕实验结果表明,盐酸去氢骆驼蓬碱可以抑制B16F10细胞的侵袭力(P<0.0001)和迁移力(P<0.05)。4.RNA-Seq序列结果表明,B16F10细胞经盐酸去氢骆驼蓬碱干预后出现944个差异表达基因。5.WB结果显示,盐酸去氢骆驼蓬碱能够使angpt-2和HIF-1α蛋白表达水平显著下降,NNT蛋白表达水平显著上升。结论:1.B16F10细胞周期阻滞在G2/M期,其增殖受到盐酸去氢骆驼蓬碱的抑制,且抑制能力随药物浓度的增大而逐步上升,此外还可以引起B16F10的凋亡及自噬。2.盐酸去氢骆驼蓬碱由于药物作用持续时间以及浓度的增大,抑制迁移和侵袭的能力也呈上升趋势。3.药物干预后B16F10细胞存在差异基因的表达,结合WB验证目的基因,提示盐酸去氢骆驼蓬碱可能通过下调HIF-1α、angpt-2抑制B16F10细胞生物学行为,通过上调NNT减少黑色素的生成,从而降低恶性黑色素瘤的发生。