文献类型：学位论文

中文题名：基于中医药化学生物信息学探讨归芪白术方通过VEGFR-2和c-Met对胃癌生长和转移的影响

作者：龚红霞[1];

第一作者：龚红霞

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：刘永琦;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：胃癌;归芪白术方;VEGFR-2/c-Met;物质基础

年份：2022

摘要：研究目的本研究基于课题组研究基础,确定归芪白术方治疗胃癌（gastric cancer,GC）的潜在作用靶点。利用化学信息学-分子对接-微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）-分子动力学（molecular dynamics,MD）模拟和细胞生物学实验揭示归芪白术方通过“多点显效、协同增效”治疗GC的物质基础和分子机制。研究方法1.基于血管内皮生长因子受体2（vascular epidermal growth factor receptor 2,VEGFR-2）和细胞间充质-上皮转化因子（cellular mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met）揭示归芪白术方治疗GC的潜在物质基础1.1基于分子对接技术揭示归芪白术方治疗GC的物质基础:根据文献确定相关靶蛋白的晶体结构和活性位点,利用Schrodinger 10.1对接软件进行归芪白术方小分子与靶蛋白的分子对接。根据分子对接结果结合分子特征筛选归芪白术方代表性小分子,MST实验检测代表性小分子与靶蛋白的体外亲和力。分子毒性预测、细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8,CCK8）实验和MD模拟技术被用于验证代表性小分子的毒性及体外活性并确定归芪白术方代表性小分子种类。1.2细胞生物学方法验证归芪白术方代表性小分子的活性:蛋白质免疫印迹（western blot,WB）实验筛选靶点蛋白高表达的GC细胞株。CCK8实验、克隆形成实验、三维（three dimensions,3D）肿瘤微球实验和WB实验验证归芪白术方代表性小分子抑制GC细胞增殖能力;流式细胞术（flow cytometry,FCM）、Hoechst 33342染色、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）检测和WB实验验证归芪白术方代表性小分子对GC细胞周期和凋亡的影响;Transwell迁移、侵袭实验和WB实验检测归芪白术方代表性小分子对GC细胞迁移、侵袭和上皮细胞间质转化（epithelial interstitial transformation,EMT）的影响;酶活实验检测归芪白术方代表性小分子对靶点蛋白激酶的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）和WB实验揭示归芪白术方代表性小分子抑制GC细胞增殖的可能作用机制。2.Transwell共培养体系探讨归芪白术方代表性小分子联合用药的效果分离、提取并鉴定脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,并与靶点蛋白高表达GC细胞株建立共培养体系,CCK8法、RT-q PCR法和WB实验评价共培养模型。适宜浓度归芪白术方代表性小分子单独或联合干预共培养的胃癌细胞,FCM、Transwell迁移、侵袭实验和WB实验检测共培养体系对共培养GC细胞周期、迁移和侵袭能力的影响及HUVEC周期和血管生成的影响;WB实验检测信号通路相关蛋白的表达。CCK8法、FCM、Transwell迁移、侵袭实验和WB实验验证归芪白术方代表性小分子对共培养条件下GC细胞的抑制作用及可能的机制。研究结果1.基于VEGFR-2和c-Met揭示归芪白术方治疗GC的潜在物质基础1.1分子对接技术揭示归芪白术方治疗GC的物质基础:分子对接结果显示归芪白术方中有156个中药小分子与VEGFR-2蛋白对接打分分值≤-7.36,这些分子主要来自甘草、大黄、当归和黄芪,有131个中药小分子与c-Met蛋白对接打分分值≤-8.20,主要来自甘草、大黄和黄芪。分别从打分排名前20位的分子中选定7个靶向VEGFR-2的小分子和4个靶向c-Met的小分子进行MST验证,结果显示大黄酸与VEGFR-2的亲和力Kd值为15.88μM,其次是甘草黄酮A（licoflavone A,LA）,K