文献类型：学位论文

中文题名：基于蛋白组学和网络药理学方法研究小儿开胃增食合剂治疗小儿厌食症的作用机制

作者：呼荟茹[1];

第一作者：呼荟茹

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：史正刚;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：小儿开胃增食合剂;厌食症;蛋白质组学;网络药理学;作用机制

年份：2022

摘要：研究目的:小儿厌食症(Pediatric anorexia,PA)是一种儿童慢性消化紊乱综合症,表现为长期食欲减退或消失、减少甚至拒绝进食,可引起营养不良、延缓发育,进而影响患者的认知能力和免疫力。小儿开胃增食合剂是临床上应用于治疗PA的中药方剂之一,已被证实疗效良好。然而,其功效背后的机制仍未被探索清楚。本研究旨在阐明小儿开胃增食合剂在治疗PA过程中的主要生物活性成分及其可能的作用机理。方法:(1)利用特制饲料诱导建立厌食症SD大鼠模型,实验分为6组:空白对照组(Control组,n=10)、模型组(Model,n=10)、西药对照组(WM组,n=10)、小儿开胃增食合剂低剂量组(Low-XZKH组,n=10)、中剂量(Middle-XZKH组,n=10)和高剂量组(High-XZKH组,n=10)。对造模期间和干预期间大鼠的进食量和体重进行测量;HE染色观察大鼠空肠和胃组织病理变化,评价小儿开胃增食合剂改善厌食症的疗效。(2)基于蛋白质组学技术对大鼠空肠和胃组织中的蛋白进行检测。筛选出差异蛋白后,对其进行功能富集、京都基因与基因组(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路以及差异蛋白间的相互作用分析,并选用蛋白免疫印迹(western blot)分析验证小儿开胃增食合剂调控的差异蛋白表达。(3)基于网络药理学方法,利用TCMSP、Dis Ge NET、TTD和OMIM数据库对小儿开胃增食合剂的有效化学成分及其作用靶点进行鉴定;对筛选出的潜在靶点进行基因本体(Gene ontology,GO)和KEGG通路分析。(4)对蛋白质组学数据和网络药理学数据进行综合分析,筛选小儿开胃增食合剂的核心靶点,western blot检测核心蛋白的表达水平,实时荧光定量PCR(Real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测核心蛋白相关通路因子m RNA的表达。结果:(1)成功建立了大鼠厌食症模型,Model组大鼠体重和进食量明显低于Control组大鼠体重和进食量(P<0.01)。给予厌食症大鼠小儿开胃增食合剂干预后,较Model组,Low-XZKH、Middle-XZKH组和High-XZKH组大鼠体重和进食量均明显增加(P<0.01),并呈剂量依赖性。(2)HE结果显示:Model组大鼠的空肠和胃组织发生了明显的病理变化,表现为空肠组织绒毛排列紊乱、胃组织腺体萎缩减少、二者结构均被破坏,组织中存在明显的炎性细胞浸润;较Model组比较,Low-XZKH、Middle-XZKH组和High-XZKH组大鼠空肠和胃组织的病理变化明显改善,并呈剂量依赖性。(3)蛋白组学结果显示,在空肠组织中共定量了4116种蛋白,与Control组比较,Model组胃组织中发现了32个差异蛋白(20个上调蛋白和12个下调蛋白);与Model组比较,XKZM组发现了77个差异蛋白(65个上调蛋白和12下调蛋白)。GO富集分析表明这些差异蛋白主要被富集到细胞过程、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)结合、抗氧化活性、蛋白结合和信号转导等过程。通路富集分析发现,这些差异蛋白明显被富集到了糖解和糖代谢合成、生物合成、胰岛素相关信号、神经组织的配体-受体间的交互作用、代谢、大鼠肉瘤(Rat sarcoma,RAS)信号和有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen a ctivated protein kinase,MAPK)信号等信号通路。蛋白互作分析结果表明,血红素结合蛋白(Helicobacter pylori,HP)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、白蛋白(Albumin,ALB)、UDP-葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UDP-glucuronyl transferase 1A1,UGT1A1)、醌NADH脱氢酶1(NADH dehydrogenase,Quinone 1,NQO1)、载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)、谷胱甘肽S转移酶3(Glutathione S transferase mu 3,GSTM3)和甲状腺素转运蛋白(Transthyretin,TTR)等蛋白作为枢纽与其它蛋白发生互作。Western blot结果表明,与Control组比较,Model组大鼠胃窦组织中磺基转移酶(Sulfotransferase1C2A,SULT1C2A)和细胞维甲酸结合蛋白2(Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2,CRABP2)等蛋白表达减少(P<0.05),烯醇酶3(Enolase 3,ENO3)和角蛋白5(Keratin5,KRT5)蛋白表达增加(P<0.05);与Model组比较,XKZM组SULT1C2和CRABP2蛋白表达增加(P<0.05),ENO3和KRT5蛋白表达减少(P<0.05)。这些差异蛋白的表达变化趋势同蛋白组学结果一致。(4)蛋白组学结果显示,在胃窦组织中共定量了3575种蛋白,与Control组比较,Model组胃组织中发现了34个差异蛋白(11个上调蛋白和23个下调蛋白);与Model组比较,XKZM组发现了71个差异蛋白(29个上调蛋白和42下调蛋白)。这些差异蛋白可被富集到多个与胃组织分泌、胃动力和胃肠保护相关的生物过程,包括组成性分泌途径的正调控、酰胺转运、组成性分泌途径的调控、内质网到高尔基神经酰胺的转运、药物跨膜转运、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成过程等过程;富集到的生物功能包括电子转运体-在Co QH2-Cyt c还原酶复合物活性内传递电子、三磷酸单酯水解酶活性、d GTPase活性、神经酰胺转运体活性、丝氨酸内肽酶活性、氧化还原酶活性、雌二醇17β脱氢酶活性、胞浆二肽酶活性、氨基酸结合、磷脂酰丝氨酸结合等。进一步通路分析发现差异蛋白与类固醇生物合成、ABC转运体、胆汁分泌、丙酮酸代谢、氨基酸代谢等通路相关。蛋白互作发现微管多特异性有机阴离子转运蛋白1(Canalicular multispecific organic anion transporter 1,Abcc2)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,Egfr)、细胞色素P450家族3亚家族a多肽62(Cytochrome P450,family 3,subfamily a,polypeptide62,Cyp3a62)、钙粘蛋白17(Cadherin-17,Cdh17)、胞浆非特异性二肽酶2(Cytosolic non-specific dipeptidase,Cndp2)、细胞色素P450家族2亚家族b多肽4(Cytochrome p450,family 2,subfamily d,polypeptide 4,Cyp2d4)、埃兹蛋白(Ezrin,Ezr)、颗粒酶A(Granzyme A,Gzma)、ATP结合盒亚家族G成员2(ATP-binding cassette sub-family G member 2,Abcg2)等蛋白占据网络图的中心,并作为枢纽与其他蛋白发生互作。Western blot结果表明与空白对照组相比较,模型组Scamp3、Tmem86a和Akr1b7蛋白的相对表达量显著升高(P<0.05),Smarcc1、Nudt13、Rpp30、Rps4y2、Art2b和Glmp蛋白的相对表达量显著下降(P<0.05);与模型组相比较,小儿开胃增食合剂组Scamp3、Tmem86a和Akr1b7蛋白的相对表达量显著下降(P<0.05),Smarcc1、Nudt13、Rpp30、Rps4y2、Art2b和Glmp蛋白的相对表达量显著升高(P<0.05)。这些差异蛋白的表达变化趋势同蛋白组学结果一致。(5)网络药理学结果显示,共筛选出142种化合物作为小儿开胃增食合剂潜在的有效成分,它们作用于PA的82个靶点,涉及26个病理途径,主要包括神经组织的配体-受体间的交互作用(27个靶点)、钙离子信号(18个靶点)、视黄醇代谢(6个靶点)、花生四烯酸代谢(6个靶点)、药物代谢(5个靶点)和脂肪细胞因子信号(5个靶点)等。(6)综合分析蛋白质组学数据和网络药理学数据,发现ATP结合盒转运蛋白G2(ATP bindingcassette subfamily G member 2,ABCG2)可作为小儿开胃增食合剂的核心靶点,该靶点与药物反应、蛋白质二聚活动和质膜区域等生物过程以及ABC转运蛋白途径相关。Western blot检测结果表明,较Control组,Model组大鼠胃组织中ABCG2蛋白表达量增多(P<0.05);较Model组,XKZH组大鼠胃组织中ABC G2蛋白表达量减少(P<0.05)。此结果与前期蛋白组学的实验结果保持一致。此外,较Control组,Model组大鼠胃组织中ABCG2、p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多药耐药相关蛋白2(Multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)m RNA表达量增多(P<0.05);较Model组,XKZH组大鼠胃组织中ABCG2、P-gp和MRP2 m RNA表达量减少(P<0.05)。结论:(1)小儿开胃增食合剂对病因模拟建造的幼龄厌食症大鼠具有明显的治疗作用。(2)小儿开胃增食合剂可提高PA模型空肠组织中血脂代谢相关因子Apoe、Nsdhl、Scp2、Dhcr24蛋白的表达,调控PA模型中ENO3、KRT5、SULT1C2A和CRABP2蛋白的表达,促进血脂代谢,影响与之相关的糖原分解与糖代谢合成、RNA降解、氨基酸的生物合成、碳代谢、ATP生成和HIF-1信号通路,达到治疗PA的效果,这可能是小儿开胃增食合剂的主要治疗靶点。(3)小儿开胃增食合剂可对PA胃窦组织中谷氨酰胺转运、合成过程,氨基酸代谢途径、能量代谢途径、胆汁分泌过程以及细胞对药物的排出途径产生影响,为小儿开胃增食合剂治疗厌食症的临床应用提供了一定的理论支持。(4)基于网络药理学方法,发现小儿开胃增食合剂共存在142种有效活性成分,它们作用于厌食症的82个靶点,主要有效成分包括懈皮素、苜蓿素、豆甾醇、茯苓酸、芒丙花青素、维斯体素、戊烯酸、异黄酮、甲氧基苯酚、肼羧酰胺、己烯酸和邻苯二甲酸二正辛酯等。PTGS2、ESR1、AR、ESR2、PTGS1、ADRB2、RXRA、ADRA1B、CHRM1和KCNH2等靶点可能是小儿开胃增食合剂抗厌食症的潜在靶点。神经活性配体-受体相互作用信号、钙离子信号、视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、间隙连接、细胞色素P450对异种生物的代谢、药物代谢、甾类激素生物合成、亚油酸的新陈代谢、色氨酸代谢和血管平滑肌收缩等途径可能是小儿开胃增食合剂抗厌食症的潜在治疗途径。(5)基于蛋白质组学和网络药理学综合分析,发现ABCG2作为懈皮素和甘草查尔酮乙的作用靶点,是小儿开胃增食合剂的核心靶点之一。ABCG2蛋白通过ABC转运蛋白途径参与其治疗过程。小儿开胃增食合剂抑制组织中ABCG2的表达,进而抑制有效活性成分的排泄,增强机体对药物的敏感性,从而达到治疗疾病的目的。