文献类型：科技成果

中文题名：探究潜在生物杀虫剂Vip3Aa16的蛋白结构及功能

完成人：修明慧[1];和建政[1];武燕[1];邓婉蓉[1];许丽丽[1];宋艳梅[1];樊涛[1];段晓晏[1];

第一作者：修明慧

完成机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

年份：2024

语种：中文

中文关键词：生物杀虫剂;生物信息学;蛋白结构

摘要：一、课题来源与背景：长期使用化学杀虫剂会导致其残留在水、土壤和其他环境成分中，对人类和生态系统造成不利的健康影响，因此生物杀虫剂应运而生。它利用目标害虫及其天敌的特性，将化学杀虫剂的风险降至最低。生物杀虫剂主要来源是细菌分泌的毒素蛋白。但由于对其毒性和致病性机制认识不足，延缓了生物杀虫剂的发展。苏云金芽孢杆菌（Bt）能够产生多种不同的细菌毒素蛋白，是研发新型生物杀虫剂的理想对象。研究发现Vip蛋白是Bt在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒素蛋白，对鳞翅目害虫具有较广泛的杀虫活性，其中Vip3Aa164已被证实能够有效杀死如棉叶虫等常见农业害虫，猜测可能结合中肠上皮细胞的特β受体，在顶端膜上形成孔隙，造成幼虫死亡，但具体机制仍不明确，阻碍了其在农业上的应用。随着技术的发展，课题组可以通过生物信息学预测，表达纯化重组蛋白，解析蛋白结构。而蛋白结构的明朗能够帮助理解蛋白的具体功能，更准确地解释如何识别宿主，发病机制，宿主感染毒素蛋白后的反应，及最终的代谢去向。因此有必要探究Vip3Aa16的结构及功能以解释其机理。二、研究目的：（1）确定重组Vip3Aa16蛋白能够在大肠杆菌系统中高效表达并成功纯化。（2）确定Vip3Aa16在自然状态下的聚集状态。（3）确定Vip3Aa16的稳定性。（4）确定Vip3Aa16在目的害虫中β受体蛋白，结合位点及作用机制。三、主要论点与论据：Vip3Aa16蛋白是由苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt) kurstaki BUPM95亚型分泌的。该课题首先利用ClustalW等分析软件，用生物信息学的手段模拟蛋白结构，预测结构域与可能的作用结合位点，及可能具有的特性。之后实验主要通过以下内容进行探索性研究。（1）利用重组质粒在大肠杆菌系统进行表达纯化提取（2）利用SDS-PAGE及凝胶过滤层析等判断聚集状态（3）利用胰蛋白酶水解及SDS-PAGE判断稳定性（4）利用Pull-down实验探究作用机制。四、创见与创新：（1）Vip3Aa16能否在大肠杆菌系统高效表达，得到纯化率高的重组蛋白？（2）Vip3Aa16在自然状态下是以什么聚集状态存在的？（3）Vip3Aa16是否稳定？（4）Vip3Aa16在目的害虫中β受体蛋白，结合位点及作用机制是什么？五、社会经济效益及存在问题：随着人们健康卫生意识的提高，对无公害的农产品的要求也越来越严格，需求也越来越大。生物杀虫剂因其具备环保、无公害、病虫害不易产生抗药性等优点，符合现在市场的需求，将逐步取代化学农药，成为主导。Vip3Aa16作为新型的潜在生物杀虫剂选择对虫害杀伤力强，而对人体无害，在进入市场之前，深入研究其结构及功能机制，可以更有效地开发相关农药制品，并对其应用范围及注意事项等精确定位。该项目对新型潜在杀虫剂成分Vip3Aa16蛋白进行了纯化及结构理化性质等的分析。然而要将该蛋白真正运用到生物杀虫剂中还需要进一步的机制、特异性、有效性及安全性实验验证。希望能够通过后续课题进行进一步探究分析。六、成果简介1.该研究通过实验与计算虚拟相结合分析新型潜在生物杀虫剂Vip3Aa16的理化性质及结构解析。得到结果如下：（1）Vip3Aa16蛋白分子式为C3953H6248N1020O1254S17,原子总数为12492，理论等电点pI为5.05，因此V ip3Aa16蛋白属酸性蛋白质。蛋白稳定性高，亲水性强。该蛋白无信号肽片段及跨膜区域，属于质膜内蛋白，属内毒素蛋白，可分析其应是被其他组分分泌至靶细胞中发挥毒素作用。磷酸化位点40个，无糖基化位点。（2）Vip3Aa16蛋白主要以α-螺旋为主，结构紧凑，根据人工智能及分子动力学模拟修正后的结构分析，其可信度较高，三级结构可将该蛋白分为五个结构域，其中Domain I为高度保守区域，Domain IV及Do main V与蛋白整体相距较远，应为可变的变构区域，在活性改变的过程中能够发生结构改变，Domain II-Domain V可能直接影响不同Vip3Aa蛋白的杀虫谱。（3）Vip3Aa16在体外可经大肠杆菌表达系统，纯化得之。2.发表《Sing-organic component g-C3.6N4 achieves superior photoactivity antibacterial》（学科Top, IF 10.67）、Drosophila as a model to study the mechanism of nociception》(IF 4.134)论文两篇。