文献类型：学位论文

中文题名：基于循证医学结合网络药理学探讨参芪扶正注射液干预胃癌作用机制的研究

作者：曹娟[1];

第一作者：曹娟

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：郑贵森;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：参芪扶正注射液;胃癌;PI3K/AKT/mTOR(AKT1);网络药理学及分子对接;作用机制

年份：2024

摘要：目的:利用循证医学、网络药理学及分子对接等技术和手段,结合体内外实验探究参芪扶正注射液治疗胃癌的临床作用及分子机制,为深入研究参芪扶正注射液干预胃癌的作用机制及临床用药提供科学依据。方法:（1）通过系统评价再评价研究整合评价分析参芪扶正注射液治疗恶性肿瘤的临床数据,从参芪扶正注射液治疗胃癌相关的系统评价和Meta分析中独立筛选随机对照试验,提取资料并评价纳入研究的偏倚风险后,采用RevMan 5.4软件进行Meta分析。（2）利用网络药理学研究,筛选参芪扶正注射液与胃癌的关键作用靶点;利用分子对接技术对关键作用靶点和主要化合物的结合力进行验证。通过GO功能富集和KEGG通路富集筛选关键信号通路。（3）以人胃癌细胞MKN45和AGS细胞为研究对象,参芪扶正注射液药物干预后,运用CCK-8法检测细胞活力、EDU实验检测增殖水平,用流式细胞术检测细胞凋亡水平。RT-PCR实验分别检测增殖相关基因PCNA和Ki67、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9和PI3K/AKT/mTOR信号通路基因表达水平,WB实验分别检测增殖相关蛋白PCNA和Ki67;凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3和Caspase9及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达水平,加入PI3K/AKT/mTOR信号通路激动剂IGF-1进一步验证。（4）实验以40只人胃癌MKN45细胞荷瘤裸鼠为研究对象,随机分为四组:模型组（Model）、参芪扶正注射液组（SQ）、顺铂组（DDP）、参芪扶正注射液+顺铂组（SQ+DDP）,经腹腔注射给药干预后,获取各组小鼠肿瘤标本,计算其抑瘤率;WB实验检测模型鼠肿瘤组织增殖相关蛋白PCNA和Ki67,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3和Caspase9及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达水平;免疫组化实验检测PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化蛋白表达。结果:（1）胃癌系统评价再评价Meta分析结果显示,相较于常规化疗组,参芪扶正注射液联合常规化疗可以提高胃癌患者的临床疗效（RR=1.38,95%CI:1.27～1.50）并改善其生活质量（RR=1.37,95%CI:1.23～1.52）。在免疫功能和不良反应方面,参芪扶正注射液联合化疗可提高患者CD3+、CD4+T细胞水平（CD3+:MD=10.59,95%CI:7.52～13.67;CD4+:MD=8.30,95%CI:5.05～11.55）,并减少血小板下降（RR=0.70,95%CI:0.58～0.85）、白细胞下降（RR=0.73,95%CI:0.60～0.90）、肾功能损害（RR=0.60,95%CI:0.36～0.97）、神经毒性（RR=0.60,95%CI:0.44～0.82）、恶心呕吐（RR=0.58,95%CI:0.50～0.67）等不良反应的发生。（2）网络药理学研究结果显示:TP53、ESR1、AKT1、JUN、MAPK3、EP300、MAPK1和SRC可能是参芪扶正注射液治疗胃癌的关键靶点,分子对接研究发现AKT1与核心有效成分化合物的结合能力最强;通过GO功能富集和KEGG通路富集,发现PI3K/AKT/mTOR信号通路、HIF-1信号通路和IL-17等信号通路可能是参芪扶正注射液治疗胃癌的关键通路;8个关键靶点富集以PI3K/AKT/mTOR信号通路最为显著,PI3K/AKT/mTOR（AKT1）信号通路可能是参芪扶正注射液治疗胃癌的最关键信号通路。（3）体外实验结果:通过CCK8实验筛选出MKN45细胞低（IC30）、中（IC50）高（IC70）干预浓度分别为130 mg/mL、150 mg/mL和170 mg/mL;AGS细胞细胞低（IC30）、中（IC50）高（IC70）干预浓度分别为60 mg/mL、80 mg/mL和110 mg/mL。EDU实验结果:与空白对照组相比,参芪扶正注射液干预组阳性细胞数明显下降（P<0.05）;流式细胞术检测结果:与空白对照组相比,MKN45和AGS细胞参芪扶正注射液干预组凋亡率显著上升（P<0.05）;RT-PCR检测结果:与对照组相比,两组细胞系参芪扶正注射液干预组PCNA、Ki67、Bcl-2和基因转录水平显著下降,Bax、Caspase3和Caspase9基因转转录水平显著升高（P<0.05）,PI3K/AKT/mTOR信号通路PI3K、AKT和mTOR基因显著下降（P<0.05）;WB检测结果:与对照组相比,两组细胞系不同浓度参芪扶正注射液干预组PCNA、Ki67、Bcl-2和蛋白表达显著下调,Bax、Caspase3和Caspase9蛋白表达显著上调（P<0.05）,与对照组相比,两组细胞系不同浓度参芪扶正注射液干预组PI3K/AKT/mTOR信号通路PI3K、AKT和mTOR蛋白无显著变化（P>0.05）,而磷酸化通路蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达显著下调（P<0.05）;加入PI3K/AKT/mTOR信号通路激动剂IGF-1后,与空白对照组相比,两组细胞参芪扶正注射液组PCNA、Ki67和Bcl-2蛋白表达均显著下调,Bax、Caspase3和Caspase9表达均上调（P<0.05）,PI3K、AKT和mTOR蛋白无显著变化（P>0.05）,而p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达显著下调;与参芪扶正注射液+IGF-1组相比:参芪扶正注射液组MKN45和AGS细胞的凋亡率、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表达均显著高于参芪扶正注射液+IGF-1组（P<0.05）;参芪扶正注射液组PCNA、Ki67、Bcl-2及p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达均低于参芪扶正注射液+IGF-1组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）体内实验结果:药物干预后,参芪扶正注射液组、顺铂组、参芪扶正注射液+顺铂组的瘤体质量均减少,差异具有统计学意义（P<0.05）;参芪扶正注射液组、顺铂组、参芪扶正注射液+顺铂组抑瘤率分别为30%、36%和52%。WB检测结果:与模型组相比,参芪扶正注射液组、顺铂组和参芪扶正注射液+顺铂组小鼠肿瘤细胞中PCNA、Ki67和Bcl-2蛋白表达均下降（P<0.05）,Bax、Caspase3和Caspase9蛋白表达均上调（P<0.05）;参芪扶正注射液组、顺铂组、参芪扶正注射液+顺铂组信号通路PI3K、AKT和mTOR蛋白无显著变化（P>0.05）,各组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著下调（P<0.05）。与参芪扶正注射液组和顺铂组相比,参芪扶正注射液+顺铂组增殖蛋白和信号通路蛋白表达均显著降低,促凋亡蛋白显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果:与模型组相比,各给药组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著下调（P<0.05）。与参芪扶正注射液组和顺铂组相比,参芪扶正注射液+顺铂组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著下调。结论:（1）参芪扶正注射液联合化疗可提高胃癌患者的临床疗效、改善生存质量、提高CD3+、CD4+T细胞水平,并减少血小板下降,白细胞下降,肾功能损害,神经毒性恶心呕吐等化疗引起的不良反应的发生。（2）AKT1是参芪扶正注射液治疗胃癌的核心靶点之一,AKT1与关键化合物的结合力最强,PI3K/AKT/mTOR（AKT1）信号通路可能是参芪扶正注射液治疗胃癌的最关键信号通路。（3）体外实验研究表明参芪扶正注射液可下调胃癌细胞PCNA和Ki67增殖蛋白、上调Bax、Caspase-3及Caspase-9促凋亡蛋白表达,下调Bcl-2抗凋亡蛋白表达;下调p-PI3K、p-AKT、p-mTOR通路蛋白。参芪扶正注射液可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制胃癌细胞增殖,促进胃癌细胞凋亡。（4）体内实验研究显示参芪扶正注射液具有抑制小鼠胃癌肿瘤生长的作用,下调p-PI3K、p-AKT、p-mTOR通路蛋白表达;通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞凋亡,发挥“扶正以祛邪”的中药功效。参芪扶正注射液与顺铂合用,具有协同增效的作用。