文献类型：学位论文

中文题名：高糖环境下MCU介导线粒体钙摄取异常与心肌细胞凋亡的机制研究

作者：陈霞[1];

第一作者：陈霞

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：陈永清;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：糖尿病心肌病;心肌细胞;线粒体钙离子单向转运体;蛋白表达;线粒体钙;细胞凋亡;高糖环境

年份：2020

摘要：研究背景：　　随着全球糖尿病患者人数的不断增加，糖尿病心肌病（DCM）已成为糖尿病患者患心血管疾病风险主要原因之一。DCM是一种与代谢改变有关，主要以左室心肌收缩、舒张功能障碍为特征的疾病，如治疗不当，会导致心律失常、心源性休克、心力衰竭，严重者甚至发生猝死。DCM的病理生理机制目前尚未得到充分阐明，近期研究发现，线粒体钙稳态失衡导致的线粒体功能紊乱是DCM发生的重要病理机制之一。线粒体钙离子单向转运体（MCU）作为钙离子转运的重要通道，是否参与了DCM的发生及发展，目前国内外极少有报道。我们前期预实验发现，在糖尿病小鼠的心肌细胞中MCU的表达减少。在细胞水平MCU表达的改变是否影响线粒体功能，进而参与DCM的发生目前尚无研究证实。因此，本研究旨在观察MCU在高糖诱导条件下的表达异常对线粒体钙摄取的影响，进而探讨高糖诱导培养心肌细胞凋亡的发生机制，为DCM的发病及临床治疗提供新靶点。　　研究目的：　　1.观察高糖培养对H9C2心肌细胞中MCU表达的影响。　　2.探讨MCU的表达改变对线粒体功能的影响进而对H9C2心肌细胞凋亡的影响及发生机制。　　研究方法：　　1.体外培养H9C2心肌细胞，分别给予高糖(HG组,葡萄糖浓度为33mmol/L)及正常糖(NG组,葡萄糖浓度为5.5mmol/L+27.5mmol/L甘露醇)培养72h，通过荧光定量PCR及Western Blot对心肌细胞MCU进行检测，Western Blot法检测心肌凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase9、Bcl-2表达，利用线粒体钙染料Rhod-2对心肌细胞线粒体钙摄取能力进行检测，JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的改变，利用ATP检测试剂盒检测线粒体ATP含量，利用NADP+/NADPH检测试剂盒及GSH/GSSG检测试剂盒检测心肌细胞抗氧化能力，利用Mito-SOXTM Red染色试剂检测心肌细胞ROS的改变，利用流式细胞术、TUNEL试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况。　　2.体外培养H9C2心肌细胞，给予正常糖培养72h，利用siRNA干涉下调MCU的表达后，分为正常组（NG组,葡萄糖浓度为5.5mmol/L）、MCU siRNA空白对照组（NG+NC siRNA组）、下调MCU表达的实验组（NG+MCU siRNA组），分别通过荧光定量PCR及Western Blot法对心肌细胞MCU进行检测，Western Blot法检测心肌凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase9、Bcl-2表达，利用线粒体钙染料Rhod-2对心肌细胞线粒体钙摄取能力进行检测，JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的改变，利用ATP检测试剂盒检测线粒体ATP含量，利用NADP+/NADPH检测试剂盒及GSH/GSSG检测试剂盒检测心肌细胞抗氧化能力，利用Mito-SOXTM Red染色试剂检测心肌细胞ROS的改变，利用流式细胞术、TUNEL试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况。　　研究结果：　　1.与正常组（NG）相比，高糖组（HG）的H9C2心肌细胞中MCU表达明显降低（P＜0.001）;线粒体Ca2+摄取量减少（P＜0.001）;膜电位水平低（P＜0.0001）、ATP生成减少（P＜0.001）;NADP+/NADPH的比值增高（P＜0.01）、GSH/GSSG比值降低（P＜0.05）;ROS生成增多（P＜0.001）;细胞凋亡增加（P＜0.01）。　　2.与正常组（NG）相比，下调MCU表达的实验组（NG+MCU siRNA）H9C2心肌细胞中MCU表达降低（P＜0.001）;线粒体Ca2+摄取量少（P＜0.001）;膜电位水平低（P＜0.0001）、ATP生成减少（P＜0.0001）;NADP+/NADPH的比值增高（P＜0.01）、GSH/GSSG比值降低（P＜0.05）、ROS生成增多（P＜0.0001）;细胞凋亡增多（P＜0.01）。　　3.与对照组（NG+NC siRNA）相比，下调MCU表达的实验组（NG+MCU siRNA）H9C2心肌细胞中MCU表达降低（P＜0.001）;线粒体Ca2+摄取量少（P＜0.0001）;膜电位水平低（P＜0.001）、ATP生成减少（P＜0.0001）;NADP+/NADPH的比值增高(P＜0.01)、GSH/GSSG比值降低（P＜0.05）、ROS生成增多（P＜0.0001）;细胞凋亡增多（P＜0.01）。　　4.对照组（NG+NC siRNA）与正常组（NG）相比，线粒体Ca2+摄取、膜电位水平、ATP生成、NADP+/NADPH的比值、GSH/GSSG比值、ROS生成及细胞凋亡均无差异(P＞0.05)。　　研究结论：　　1.在高糖环境中，H9C2心肌细胞的MCU表达下降,线粒体钙摄取减少。　　2.MCU的表达下降引起线粒体功能障碍、ROS生成增多，氧化应激增强。　　3.MCU的表达下调引起心肌细胞凋亡增加。