文献类型：科技成果

中文题名：消痰化瘀抗纤方药物血清对肝星状细胞增殖及其胶原降解相关基因表达的影响

登记号：2009Y0208

完成人：韩涛[1];杨少军[1];兰咏梅[1];刘凤艳[1];王佳蕾[1];吴建军[1];马骏[1];楚惠媛[1];李广远[1];史正刚[1];刘健鸿[1];夏琦[1];

第一作者：韩涛

完成机构：[1]甘肃中医学院;

第一机构：甘肃中医药大学

年份：2009

语种：中文

中文关键词：Sc;消痰;化瘀;药物血清;P

摘要：一、技术原理：　　目前认为，肝星状细胞(HSC)产生Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原。肝纤维化早期，Ⅳ型胶原增多，发展至肝硬化时，Ⅰ、Ⅲ型胶原明显增多，以Ⅰ型胶原为主。肝细胞坏死能激活HSC并使之增殖。活化的HSC是HF形成的关键，是HF最终的共同通路，是HF发生的细胞学基础。在正常情况下，肝脏中细胞外基质(ECM)的沉积和降解处于动态平衡状态。当有过量ECM产生时，会被基质金属蛋白酶(MMPs)降解。研究发现其中MMP-1基因表达在HF发生发展阶段逐渐增强，但形成明显肝硬化后基因表达下降。研究表明中药抗纤维化具有良好疗效和较少毒副作用。中药及复方作用机制研究是中药现代化的热点和难点，血清药理研究克服了中药在动物离体实验中许多理化因素对实验的干扰。消痰化瘀抗纤方是多年临床应用防治HF的经验方，从中医学痰饮、血瘀致病入手，以消痰软坚、活血化瘀立法，由瓦楞子、当归、茵陈、青皮等七味中药组成。研究消痰化瘀抗纤方药物血清对HSC增殖，Ⅰ型胶原分泌降解以及相关细胞因子的合成表达的影响，阐明该方抗肝纤维化的细胞分子学机制及中医学对肝纤维化的辨证论治规律。　　二、性能指标：　　①消痰化瘀抗纤方药物血清对HSC增殖影响的研究；②消痰化瘀抗纤方对肝星状细胞上清液Ⅰ型胶原降解影响的研究；③消痰化瘀抗纤方对肝星状细胞TIMP-1和MMP-1表达影响的研究。　　实验方法为体外培养HSC-T6大鼠肝星状细胞株。SD大鼠随机分为5组，空白对照组，阳性对照组，消痰化瘀抗纤方（简称“抗纤方”）高剂量组，抗纤方中剂量组，抗纤方低剂量组。采用血清药理学方法，制备药物血清，配成含10%药物血清的培养基。以正常大鼠血清和药物血清干预HSC 24h、48h、72h后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测抗纤方药物血清对HSC的增殖抑制作用；取药物血清干预HSC 24h、48h、72h后的细胞上清液，用ELISA法测定HSC 分泌的Ⅰ型胶原的变化量；采用RT-PCR法检测细胞中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的mRNA表达。　　研究结果表明，MTT实验显示抗纤方高（13.5倍）、中（4.5倍）、低（1.5倍）剂量组药物血清与对照组相比能明显抑制HSC增殖(P＜0.05)，且增殖抑制率与剂量呈正相关，与作用时间呈正相关，抗纤方高剂量组72h后的作用最明显，增殖抑制率达到21.73%；ELISA法检测Ⅰ型胶原含量显示，抗纤方各剂量组药物血清与对照组相比HSC分泌Ⅰ型胶原的量随时间延长和剂量增加明显降低(P＜0.05)，作用72h后的高剂量组的Ⅰ型胶原的量明显低于各组(132.05±4.03ng·ml^(-1))；RT-PCR法证实，抗纤方药物作用HSC 24h后与对照组比较能明显抑制TIMP-1 mRNA的表达(P＜0.05)，促进MMP-1 mRNA的表达(P＜0.05)。抗纤方低剂量组对TIMP-1的抑制作用最明显，抗纤方高剂量组对MMP-1的促进作用最明显。　　该课题研究证实，消痰化瘀抗纤方抗肝纤维化的作用机制是抑制HSC的增殖，减少HSC对Ⅰ型胶原的分泌，抑制HSC中TIMP-1的表达，促进MMP-1的表达，使细胞外基质降解，从而起到防治肝纤维化的作用，为抗纤方临床应用提供了实验研究基础。　　三、成果的创造性、先进性：　　1.该课题针对肝纤维化为“癥瘕积聚”的认识，从中医学痰饮、血瘀致病，“痰瘀互结”入手，以消痰软坚、活血化瘀立法论治。其特点在于不仅要活血化瘀，更为重要的是祛痰。　　2.该研究所选用的消痰化瘀抗纤方为多年用于治疗肝纤维化，临床疗效良好的经验方，由瓦楞子、当归、茵陈、青皮等七味中药组成，具有化痰除湿、活血软坚的功效。　　3.应用细胞分子生物学研究方法，选用HSC增殖、Ⅰ型胶原分泌量、HSC中TIMP-1的表达、MMP-1的表达作为检测指标，阐述消痰化瘀抗纤方防治HF的作用机理。　　4.应用血清药理学研究方法，克服了中药在动物离体实验中许多理化因素对实验的干扰，并结合药物量效关系、时效关系，阐述消痰化瘀抗纤方防治HF的作用机理。　　四、社会意义：　　慢性肝病是严重威胁人类健康的一类主要疾病。肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的中间过程，是可逆的，可防可治，该课题应用细胞分子生物学、血清药理学方法，研究结果令人满意，消痰化瘀抗纤方能够抑制HSC增殖，减少HSC对Ⅰ型胶原分泌，抑制HSC中TIMP-1表达，促进MMP-1表达，使细胞外基质降解，起到防治肝纤维化的作用。　　中医药有着数千年的悠久历史，具有灵活组方和辨证论治的优势，结合现代医学认识疾病的客观性、微观性、准确性，有利于从更宽的视角探讨中医药治疗肝纤维化的机制，充分发挥中医药治疗肝纤维化的特色，为中医辨证论治肝纤维化提供新思路。