文献类型：学位论文

中文题名：基于JAK2/STAT3信号通路探讨舒肝化癥方防治肝纤维化的作用机制

作者：田萌媛[1];

第一作者：田萌媛

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：陈光顺;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：舒肝化癥方;隐丹参酮;肝纤维化;肝星状细胞;JAK2/STAT3信号通路;炎症

年份：2024

摘要：目的本研究在国医大师周信有教授的验方舒肝化癥方临床有效治疗肝纤维化的基础上,通过体内外实验及入血成分分析进一步证实舒肝化癥方及其重要有效成分隐丹参酮对CCL4诱导的肝纤维化大鼠及PDGF诱导的大鼠肝星状细胞的干预作用,并从炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及JAK2/STAT3信号通路揭示其改善肝纤维化的具体分子机制。方法1实验一:SPF级雄性SD大鼠54只,适应性喂养后根据随机数字表将其随机分为空白组、模型组、阳性对照组、舒肝化癥方低、中、高剂量组,每组各9只;除空白组大鼠外,其余各组大鼠均采用40%CCL4橄榄油溶液腹腔注射造模,剂量为2mL/kg,每周同一时间2次,持续8周;空白组大鼠不做任何处理、正常饲养;阳性对照组给予0.2mg/kg的秋水仙碱进行灌胃,每日1次,连续8周;舒肝化癥方高、中、低剂量组分别给予29.52g/kg、14.76g/kg、7.38g/kg的舒肝化癥方溶液进行灌胃,每日1次,连续8周。实验期间观察大鼠一般情况、肝组织病理改变;采用ELISA试剂盒检测大鼠肝组织α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）、IV型胶原蛋白（Collagen IV）、层粘连蛋白（LN）的含量;采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测大鼠肝组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、JAK2、STAT3 mRNA相对表达量;采用蛋白免疫印迹（WB）法检测大鼠肝脏组织中JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。2实验二:舒肝化癥方入血成分分析:SD雄性大鼠20只,适应性喂养后,根据随机数字表随机分为空白组、舒肝化癥方含药血清组;舒肝化癥方组大鼠采用29.52g/kg的舒肝化癥方溶液进行灌胃,每日1次,连续7d,空白组大鼠给予等量的蒸馏水进行灌胃,每日1次,连续7d。末次给药2h后麻醉取血,采用入血成分分析技术预测舒肝化癥方的入血成分及效应小分子的筛选。3实验三:采用CCK-8检测不同浓度PDGF及隐丹参酮对HSC-T6细胞的增殖的影响;将HSC-T6分为空白组、模型组、隐丹参酮组、抑制剂组、联合组;空白组正常培养不进行操作,模型组采用10ng/mL的PDGF干预48h,各给药组先采用10ng/mL的PDGF干预4h进行诱导,后加入对应的药物[隐丹参酮组（40μmol/L）;抑制剂组（25μmol/L的AG490）;联合组（40μmol/L的隐丹参酮+25μmol/L的AG490）]培养至48h。ELISA法检测细胞上清中α-SMA、CollagenⅠ、Collagen IV、LN的表达水平;免疫荧光法检测细胞中α-SMA的含量;采用RT-q PCR检测HSC-T6细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α、JAK2、STAT3 mRNA相对表达量;采用WB法检测HSC-T6细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达水平。结果1动物实验（1）舒肝化癥方对各组大鼠一般状况的影响:实验期间空白组大鼠体质量逐渐增加,精神状态良好,毛发油亮光滑;模型组大鼠饮食量减少,体质量增长缓慢,精神状态差、毛发晦暗无光、枯槁稀疏,小便色黄,大便稀溏;与模型组比较,各给药组大鼠的精神状态明显好转,体质量增长渐正常,毛发状态明显改善。（2）舒肝化癥方对各组大鼠纤维化程度的影响:与空白组比较,模型组大鼠肝脏组织中α-SMA、LN、CollagenⅠ、Collagen IV表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,舒肝化癥方各剂量组及秋水仙碱组大鼠肝脏组织中α-SMA、LN、CollagenⅠ、Collagen IV表达水平显著降低（P<0.05）。（3）舒肝化癥方对各组大鼠肝组织病理改变的影响:HE染色结果显示:空白组大鼠肝细胞结构完整、排列整齐,肝小叶清晰可见;与空白组比较,模型组大鼠大多数肝细胞变性坏死、结构被破坏,肝细胞内含有大小不等的脂肪滴,仅见小部分肝细胞完好,肝小叶结构不明显,肝细胞出现不同程度的脂肪样变,形成明显的纤维间隔;与模型组比较,各给药组大鼠肝细胞内的脂肪滴均有不同程度的改善,肝小叶结构基本可见,肝组织脂肪样变现象均有不同程度的改善。天狼猩红染色结果显示,空白组大鼠仅在汇管区有少量的胶原沉积,与空白组比较,模型组大鼠肝组织纤维化已经形成,并且形成纤维间隔;与模型组比较,各给药组胶原蛋白沉积减少,纤维化程度均有不同程度的改善。（4）舒肝化癥方对各组大鼠纤维化标志蛋白及炎症因子的影响:与空白组比较,模型组大鼠肝脏组织中α-SMA、CollagenⅠ、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,舒肝化癥方高、中剂量组及秋水仙碱组α-SMA、CollagenⅠ、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）;舒肝化癥方低剂量组α-SMA、CollagenⅠmRNA及蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）。（5）舒肝化癥方对各组大鼠JAK2/STAT3信号通路表达的影响:与空白组比较,模型组大鼠肝脏组织中JAK2、STAT3 mRNA表达水平及JAK2、STAT3、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,舒肝化癥方各剂量组及秋水仙碱组大鼠肝脏组织中JAK2、STAT3 mRNA表达水平及JAK2、STAT3、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。2入血成分分析入血成分分析结果显示:在舒肝化癥方入血成分中发现两个丹参的小分子成分,分别是隐丹参酮和丹酚酸D,可知丹参的小分子在防治肝纤维化中发挥着作用;本实验选用隐丹参酮验证其防治肝纤维化的作用机制。3细胞实验（1）CCK-8结果显示:不同浓度的PDGF对HSC-T6细胞均有诱导作用,根据实验结果选择10ng/mL的PDGF干预48h进行造模;不同浓度的隐丹参酮对PDGF诱导的HSC-T6细胞均有抑制增长的效果,根据实验结果选择40μmol/L作为后续实验的浓度。（2）隐丹参酮对各组HSC-T6细胞纤维化标志物的影响:与空白组比较,模型组HSC-T6细胞上清中α-SMA、CollagenⅠ、Collagen IV、LN表达量显著升高（P<0.05）;与模型组比较,隐丹参酮组、抑制剂组及联合组HSC-T6细胞上清中α-SMA、CollagenⅠ、Collagen IV、LN表达量显著降低（P<0.05）。免疫荧光结果显示,与空白组比较,模型组HSC-T6细胞中α-SMA的表达显著升高（P<0.05）;与模型组比较,各给药组HSC-T6细胞中α-SMA的表达显著降低（P<0.05）。（3）隐丹参酮对各组HSC-T6细胞纤维化标志物及炎症因子mRNA及蛋白的影响:与空白组比较,PDGF诱导的HSC-T6细胞中α-SMA、CollagenⅠ、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,各给药组HSC-T6细胞中α-SMA、CollagenⅠ、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）。（4）隐丹参酮对各组HSC-T6细胞中JAK2/STAT3信号通路的影响:与空白组比较,模型组HSC-T6细胞中JAK2、STAT3 mRNA及JAK2、STAT3、P-JAK2、P-STAT3蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,各给药组HSC-T6细胞中JAK2、STAT3 mRNA及JAK2、STAT3、P-JAK2、P-STAT3蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）。结论1舒肝化癥方可以改善肝纤维化大鼠的一般生存状态和肝脏病理改变,延缓肝纤维化的发展,其作用机制可能与舒肝化癥方调节肝纤维化大鼠肝组织中JAK2/STAT3信号通路及炎症因子的表达有关。2舒肝化癥方入血成分中重要有效成分隐丹参酮可以抑制HSC-T6细胞的增殖、降低细胞中纤维化标志蛋白α-SMA、CollagenⅠ的表达,从而延缓肝纤维化进程,其作用机制可能与隐丹参酮调节HSC-T6细胞中JAK2/STAT3信号通路及炎症因子的表达有关。3体内外实验结果显示舒肝化癥方可以有效延缓肝纤维化的发展,其入血成分隐丹参酮可能是其效应小分子。