文献类型：学位论文

中文题名：甘肃省13种药用植物根际和内生菌的分离及5株功能菌株鉴定和抑菌促生功能测定

作者：吕娇娇[1];

第一作者：吕娇娇

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：王艳;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：药用植物;内生细菌;根际菌株;拮抗能力;促生能力

年份：2022

摘要：以甘肃省13种药用植物为材料,采用常规的稀释涂布平板法分离内生及根际细菌,明确其数量特征及分布特点;通过固氮、溶磷、产IAA和抑菌功能指标初步检测菌株的促生能力;测定筛选出的5株功能菌株的抑菌物质在p H、温度、紫外照射及储存条件下的稳定性,为抑菌机理的研究奠定基础;通过种子萌发试验进一步测定5株功能菌株的促生活性;利用常规技术及16S r DNA序列分子技术对5株功能菌株进行鉴定,确定其系统发育地位;初步提取5株功能菌株中的抑菌物质,并利用显微技术,观察并分析5株功能菌株对病原真菌的抑菌机理。本研究分离出多株具固氮、溶磷、产IAA和抑菌能力的功能菌株,为特定药用植物菌肥、菌剂的研发奠定基础。主要得到以下结果:1.采用常规的稀释涂布平板法从13种药用植物根际和体内分离菌株,结果表明:本研究从13种药用植物根际土壤中共分离出1169株菌株,平均菌群密度为1.05×10cfu·g;13种药用植物不同时期内生细菌的数量特征为植株生长旺盛期>植株生长采收期>植株生长苗期,不同部位内生细菌的数量分布特征为根>茎>叶;13种药用植物的平均菌群密度为3.84×10 cfu·g。2.通过固氮、溶磷、产IAA和抑菌功能指标初步筛选根际促生菌株,结果表明:从13种药用植物根际土壤中分离出347株固氮菌株、78株溶磷菌株、699株产IAA菌株和18株拮抗菌株,分别占总分离根际菌株数量的46.79%、6.67%、59.79%和1.37%;共筛选出具稳定固氮能力的根际菌株72株;具稳定溶磷能力的根际菌株有12株,溶无机磷量的范围为1.21～38.87mg·L;84株根际菌株产IAA量较多,分泌量的范围为6.28～46.42mg·L;18株根际菌株的抑菌活性在21.51%～68.21%之间,DST21、DST27、WTT25、HQT43及DT32这5株根际菌株对锐顶镰刀菌和灰葡萄孢菌等7种病原真菌均有不同程度的抑制作用。3.通过固氮、溶磷、产IAA和抑菌功能指标初步筛选内生促生细菌,结果表明:从13种药用植物体内分离出318株固氮细菌、60株溶磷细菌、589株产IAA细菌及14株拮抗细菌,分别占总分离出内生细菌数量的31.58%、5.69%、58.29%和1.39%;具稳定固氮能力的内生细菌48株;具稳定溶磷能力的内生细菌17株,内生细菌的溶无机磷量的范围为2.54～49.37 mg·L;62株内生细菌产IAA量较多,分泌量在5.10～56.38 mg·L,分泌量在40 mg·L以上的内生细菌有6株;14株内生细菌的抑菌活性在18.74%～53.01%之间,DSG3、DSY6和KDG5这三株内生细菌对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和木贼镰刀菌3种病原真菌均有不同程度的抑菌作用。4.通过对5株功能菌株上清液进行不同的处理,研究其抑菌物质的稳定性发现:5株功能菌株的抑菌物质对紫外和储存时间较稳定,不会因为长时间的紫外照射和储存时间而降解;5株功能菌株的抑菌物质对温度和酸碱度相对较稳定,5株功能菌株上清液经28℃～60℃处理后,对抑菌物质的稳定性基本无影响,经p H 6～8处理后,抑菌物质的稳定性也基本不变。5.通过研究不同浸种时间和浸种浓度的5株功能菌株发酵上清液对黄芪种子萌发的影响,测定5株菌株对黄芪种子萌发率、发芽指数、发芽势和平均发芽速度4个指标得出:DST21、DST27、WTT25、HQT43和DT32这5株功能菌株上清液的最佳浸种时间分别为4 h、6 h、4 h、8 h和4 h;DST21、DST27和WTT25上清液的最佳浸种浓度为9.45×10 cfu·m L、9.05×10 cfu·m L和8.95×10cfu·m L,HQT43和DT32培养120 h的发酵原液为最佳浸种浓度。6.结合形态学特征、生理生化特征及16S r RNA分子鉴定得出:DST21、DST27、WTT25、HQT43和DT32这5株功能菌株分别鉴定为短短芽孢杆菌(B.brevis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)、微白黄链霉菌(S.albidoflavus)和卡那霉素链霉菌(S.kanamyceticus)。7.根据相似相溶的原理,采用不同极性的有机溶剂提取抑菌物质,对5株功能菌株抑菌物质活性成分富集极性段进行确定:DST21和DST27抑菌物质的粗提取应选氯仿作为萃取溶剂,WTT25、HQT43和DT32抑菌物质的粗提取应选丙酮作为萃取溶剂;利用显微技术,观察并分析菌株对病原真菌的作用机理发现:DST21、DST27和WTT25这3株菌株对病原真菌的抑菌作用基本相同,菌丝生长异常,形态畸形,变细,节间变短变粗,粗细不均,细胞原生质收缩,菌丝断裂,解体;HQT43和DT32这2株菌株对病原真菌的抑菌作用基本相同,菌丝的中部及顶端膨大,扭曲或畸形,形成分隔,菌丝体内原生质聚集成块,引起菌丝细胞变大及变形,体壁溶解,最终菌丝裂解。