文献类型：学位论文

中文题名：冬凌草甲素通过下调LncRNA AFAP1-AS1的表达抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移及侵袭的作用及机制研究

作者：李志明[1];

第一作者：李志明

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：龙凤;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：乳腺癌;冬凌草甲素;lncRNA AFAP1-AS1;迁移;侵袭

年份：2021

摘要：目的 通过观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默肌动蛋白丝相关蛋白1-反义RNA1(actin filament-associated protein1 antisense RNA 1,AFAP1-AS1)并联合冬凌草甲素(oridonin,ORI)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,分析AFAP1-AS1参与调控的通路分子,进而探寻ORI通过调控lncRNA AFAP1-AS1抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭可能的分子机制,旨在进一步揭示冬凌草甲素抗乳腺癌作用的新分子靶标,从而为以lncRNA AFAP1-AS1为靶点研发治疗乳腺癌的靶向药物及药物组合提供药理学依据和奠定科学理论基础。 方法 1.在线数据库分析lncRNA AFAP1-AS1在三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)组织中的差异表达并确定lncRNA AFAP1-AS1高表达或低表达与乳腺癌患者生存期的关系。2.CCK-8法、细胞克隆形成实验分别检测不同浓度的ORI对MDA-MB-231细胞活力和克隆形成能力的影响;利用siAFAP1-AS1及其阴性对照(siNC)转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,qPCR分析检测ORI、siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞中Lnc RNA AFAP1-AS1表达的影响;CCK-8法检测空白组、4μg/mL ORI组、si-NC组、siAFAP1-AS1组、si-NC+4μg/mL ORI组和siAFAP1-AS1+4μg/mL ORI组中MDA-MB-231细胞的细胞活力。3.划痕实验、Transwell侵袭实验研究空白组、4μg/mL ORI组、si-NC组、siAFAP1-AS1组、si-NC+4μg/mL ORI组和siAFAP1-AS1+4μg/mL ORI组中MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。4.蛋白免疫印迹法分析检测空白组、4μg/mL ORI组、si-NC组、siAFAP1-AS1组、si-NC+4μg/mL ORI组和siAFAP1-AS1+4μg/mL ORI组中MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白的表达情况。5.基于生物信息学技术分析预测lncRNA AFAP1-AS1的靶基因。6.Western blot检测空白组、4μg/mL ORI组、si-NC组、siAFAP1-AS1组、si-NC+4μg/mL ORI组和siAFAP1-AS1+4μg/mL ORI组中MDA-MB-231细胞Cdc42、MAP3K10蛋白表达水平。 结果 1.lncRNA AFAP1-AS1在TNBC组织中表达上调且与乳腺癌患者生存不良相关。2.ORI明显抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞活力和细胞克隆增殖能力,并呈剂量依赖性;ORI下调lncRNA AFAP1-AS1在MDA-MB-231细胞中的表达;与si-NC对照组相比,沉默lncRNA AFAP1-AS1在MDA-MB-231细胞中的表达,细胞存活率显著降低且siAFAP1-AS1和ORI联合使用对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用较其它组更为明显。3.siAFAP1-AS1能明显抑制MDA-MB-231细胞迁移率和穿过Transwell小室细胞数目,且siAFAP1-AS1联合ORI(4μg/mL)组对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的抑制作用明显高于siNC/ORI对照组。4.与单独应用ORI或siAFAP1-AS1相比,ORI联合siAFAP1-AS1可显著下调MDA-MB-231细胞中EMT相关蛋白N-cadherin和Vimentin的表达,上调E-cadherin的表达。5.在线数据库预测AFAP1-AS1靶基因共220个,筛选出的靶基因的功能富集与包括乳腺癌在内的多种癌症相关,显著性富集的信号通路有3条,包括MAPK、PI3K-Akt和催乳素信号通路。6.与单独应用ORI或siAFAP1-AS1相比,ORI联合siAFAP1-AS1显著下调MDA-MB-231细胞中Cdc42、MAP3K10的蛋白表达。 结论 1.ORI联合siAFAP1-AS1显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭,并能够下调N-cadherin和Vimentin蛋白的表达、上调E-cadherin蛋白表达进而抑制EMT进程。 2.ORI下调lncRNA AFAP1-AS1抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制可能与阻断Cdc42/MAP3K10通路有关。