文献类型：学位论文

中文题名：基于Th17/Treg细胞及肠道菌群探究钩藤碱对自发性高血压大鼠的影响和作用机制

作者：张国欣[1];

第一作者：张国欣

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：郑贵森;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：钩藤碱;自发性高血压大鼠;肠道菌群;Th17;Treg

年份：2022

摘要：目的:观察钩藤碱干预自发性高血压大鼠(SHR)的作用效应,并从Th17/Treg细胞和肠道菌群途径探索其潜在的作用机制,以期为钩藤碱治疗高血压的临床应用提供新的科学依据。方法:1.钩藤碱治疗高血压的网络药理学分析方法。从Swiss Target Prediction数据库预测钩藤碱靶点,TTD、CTD、Gene Cards、Durg Bank数据库收集高血压靶点。取药物靶点与疾病靶点的交集进行GO和KEGG富集分析,并构建药物-疾病-靶点-通路网络。2.钩藤碱调控自发性高血压大鼠Th17/Treg细胞平衡作用的实验方法。50只8周龄雄性自发性高血压大鼠,随机分为模型组(Model组)、阳性对照组(CAP组,卡托普利)、钩藤碱高剂量组(Rhy H组)、钩藤碱中剂量组(Rhy M组)和钩藤碱低剂量组(Rhy L组),以同周龄Wistar大鼠为正常对照组(NC组)。空白对照组和模型组用等体积的生理盐水灌胃。灌胃给药每天1次,持续6周。观察各实验组大鼠的一般情况(精神、反应、毛发、二便等);采用无创血压仪每周测量各实验大鼠的血压;6周后,采用流式细胞术检测各组实验大鼠外周血Th17和Treg细胞占CD4+T细胞比例的变化;采用ELISA法检测大鼠血清炎症指标hs-CRP、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10和TGF-β水平。3.钩藤碱对自发性高血压大鼠肠粘膜屏障干预作用的实验方法。ELISA法检测血清连蛋白Zonulin释放量;采用生化法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色法和Masson染色法观察实验大鼠回肠、结肠组织形态学变化;采用免疫组化法、蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)检测回肠、结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表达。4.钩藤碱对自发性高血压大鼠肠道菌群干预作用的实验方法。采用16S r DNA扩增子测序技术检测肠道菌群结构的变化。结果:1.网络药理学探讨钩藤碱治疗高血压的可能机制研究网络药理学分析显示,钩藤碱治疗高血压共有靶点14个。这些靶点富集于钙信号通路、神经活性配体-受体反应、IL-17信号通路等。2.大鼠一般状态观察与正常对照组比较,模型组大鼠烦躁易怒,抓取时反抗剧烈,常有咬人动作,毛色枯黄蓬乱,大便干,小便深黄;各药物干预组大鼠上述表现均有不同程度的改善。3.大鼠血压检测结果与正常对照组比较,模型组大鼠血压显著升高(P<0.01);与模型组比较,药物干预1周后,卡托普利组和钩藤碱高、中剂量组血压降低(P<0.05);药物干预2、3、4、5、6周后,卡托普利组和钩藤碱不同剂量组大鼠血压降低(P<0.05)。4.钩藤碱调控自发性高血压大鼠Th17/Treg细胞平衡的影响4.1与正常对照组比较,模型组大鼠血清炎症指标hs-CRP、TNF-α、IL-17、IL-6、TGF-β水平显著升高,IL-10水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,卡托普利组和钩藤碱高剂量组大鼠hs-CRP水平降低(P<0.05);卡托普利组和钩藤碱高、中剂量组大鼠IL-6、TGF-β水平降低(P<0.05);卡托普利组和钩藤碱高、中、低剂量组大鼠TNF-α、IL-17水平降低(P<0.01);卡托普利组和钩藤碱高、中、低剂量组大鼠血清IL-10水平升高(P<0.01)。4.2与正常对照组比较,模型组大鼠Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比下降(P<0.01);与模型组比较,卡托普利组和钩藤碱高、中剂量组大鼠Th17细胞百分比降低,Treg细胞百分比升高(P<0.05)。4.3相关性分析提示,自发性高血压大鼠血压与hs-CRP、TNF-α、IL-17、IL-6、TGF-β水平呈正相关(P<0.01),与IL-10水平呈负相关(P<0.01)。5.钩藤碱对自发性高血压大鼠肠粘膜屏障的影响5.1与正常对照组比较,模型组大鼠肠粘膜通透性指标Zonulin释放量升高(P<0.01);与模型组比较,卡托普利组和钩藤碱高、中剂量组大鼠Zonulin释放量降低(P<0.05)。5.2与正常对照组比较,模型组大鼠血清SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.01);与模型组比较,卡托普利组和钩藤碱不同剂量组大鼠血清SOD水平升高,MDA水平降低(P<0.05)。5.3与正常对照组比较,模型组大鼠回肠被覆肠绒毛连续性破坏,上皮细胞变性坏死,有脱落,肠壁伴充血水肿、多量炎细胞浸润,固有层肠腺排列较疏松,可见萎缩肠腺管腔缩小,胶原纤维表达增多。给予药物干预后,上述病理变化均有不同程度的改善,介于空白对照组和模型组之间。与正常对照组比较,模型组大鼠结肠组织粘膜上皮细胞有变性坏死、脱落,肠粘膜不完整,肠壁凹陷,可见充血水肿、多量炎细胞浸润,胶原纤维表达增多。给予药物干预后,上述病理变化均有不同程度的改善,介于空白对照组和模型组之间。5.4免疫组化和免疫印迹结果提示:与正常对照组比较,模型组大鼠回肠和结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1染色减弱,各蛋白表达均降低(P<0.01);与模型组比较,卡托普利组和钩藤碱不同剂量组回肠和结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1染色增强,各蛋白表达均增加(P<0.05)。6.钩藤碱对自发性高血压大鼠肠道菌群的影响模型组大鼠肠道菌群丰富度降低,在不同分类水平上物种相对丰度发生变化;与模型组比较,各药物干预组可一定程度上提高肠道菌群丰富度,重塑肠道菌群结构,在门水平和属水平可上调Bacteroidetes、Cyanobacteria、Prevotella丰度,下调Firmicutes、Ruminococcus、Oscillospira丰度。结论:1.自发性高血压大鼠Th17/Treg细胞的比例失衡,相关炎症细胞因子表达异常;肠道通透性增加,肠粘膜屏障破坏,肠道菌群紊乱。2.钩藤碱可以降低血压,其机制可能与调节自发性高血压大鼠肠道菌群稳态,修复损伤的肠粘膜屏障,恢复Th17/Treg细胞平衡,减轻炎症损伤程度相关。