文献类型：学位论文

中文题名：当归根癌病病原菌鉴定及药剂防治研究

作者：张婷[1];

第一作者：张婷

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：王艳;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：当归根癌病;病原鉴定;有效成分含量测定;室内毒力测定;田间药剂防治

年份：2023

摘要：当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]为伞形科多年生草本植物,以根入药,有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。甘肃岷县为当归的道地产区,种植面积达30万亩,占全国当归种植面积的40%;产量42 834 t,占全国总产量的80%。近年来当归病害发生严重,已知的有茎线虫（麻口）病（Ditylenchus destructor Thorne）、水烂病（Pseudomonas fluorescens Migala）和根腐病[Fusarium avenaceum（Fr.）Sacc.]等14种,对当归品质产生巨大影响。2021年在对甘肃省药用植物病害调查过程中,在当归植株上发现了一种新病害,症状表现为在根部形成大小不等的瘤状物,据症状,将该病暂定为根癌病,系统查阅国内外资料,尚无研究报道。因此,本课题组在2020～2022年间通过调查甘肃省当归不同主产区根癌病病害发生危害情况,采集标样,将植物病理学常规技术和分子生物学理论手段相结合,对该病的病原菌及其生物学特征、病害发生条件及发生规律、综合防治技术及根癌病病害对当归药材主要成分的影响进行系统研究,不仅丰富和填补了我国药用植物病原细菌种类的研究内容,并且形成综合防控技术体系为有效地控制此病,指导绿色无公害当归药材的生产提供技术支撑,在理论和实践中均具有重要意义。研究结果如下:1.分别于2021年9月、10月和12月,2022年11月和12月间分批分次对甘肃省岷县、渭源县、漳县等当归主产区根癌病病害进行调查。采用五点取样法取样,观察并记录病害植株根部瘿瘤的形状、颜色、大小及虫害情况等,保鲜带回实验室进行病原菌的分离。调查发现,该病在甘肃省岷县、渭源、漳县和榆中县等当归主产区均有发生,病程贯穿当归的整个生长周期,以7～9月发病最为严重。病害植株整体矮小,地上部分症状不明显,根部发病严重,产生形态各异、大小不一的瘿瘤。幼瘤光滑,乳白色至乳黄色,病瘤随着植株的生长而变大,大小为0.2～1.0 cm,颜色逐渐加深变为褐色或黑褐色,表面变得粗糙,最后溃烂。有与茎线虫麻口病（D.destructor Thorne）和根腐病[F.avenaceum（Fr.）Sacc.]共同产生的情况。瘿瘤的产生及其生长严重阻碍了当归植株的正常生长,影响当归药材的品质。2.运用常规组织分离法,分别在含Ca CO的PDA培养基、甘露糖醇培养基、MW、YMA、YEB和NA 6种培养基上分离多样地当归根癌病病害标样,共分离出21株与根癌土壤杆菌菌落形态相似的菌株。经氢氧化钾拉丝试验与革兰氏染色试验筛选出12株革兰氏阴性菌,分别为:MW2、MW3、MW4、NA2、NA3、NAY、YEB3、YEB4、YMA3、YMA4、YMAY和ZY。采用向日葵茎部针刺接种法、胡萝卜切片法和当归幼苗刺伤接种法对分离得到的病原菌进行致病性检测,结果显示12株革兰氏阴性菌中只有菌株NA3能使向日葵茎杆和当归植株根部产生瘿瘤,使胡萝卜圆片产生愈伤组织。病原菌NA3在MW培养基上呈浅灰黄色,在含Ca CO的PDA培养基上呈灰白色,在YEB培养基上呈浅黄色,3种培养基上均为粘稠,不透明,有光泽,边缘整齐的圆形突起。革兰氏染色阴性;扫描电子显微镜下菌体呈杆状,大小范围约为（1.24～2.09）μm×（1.86～2.05）μm。提取病原菌的DNA,PCR扩增16Sr RNA和gyr B序列,对其进行分子鉴定,鉴定致病菌为根癌土壤杆菌[Agrobacterium tumefaciens（Smith&Townsond）Conn.]。通过离体培养,对菌株NA3进行生理生化测定,结果显示病原菌在含3-酮基乳糖的培养基上产生黄色晕圈;对盐耐受;35℃下生长良好;石蕊牛奶试管在接种菌株NA3后产生酸凝作用,变色,凝固;酒石酸盐阴性,为蓝绿色并产生大量醋酸铅沉淀,符合生物Ι型土壤杆菌的生理生化特征,初步判断该株菌为生物Ι型根癌土壤杆菌。3.通过高效液相色谱法（HPLC）多指标成分测定及指纹图谱多模式识别不同样地有瘤病害当归（病株）与无瘤健康当归（健株）药材主要有效成分的质量差异,结果显示,HPLC指纹图谱共标定了14个共有峰,指认出绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯和丁烯基苯酞6个色谱峰。含量测定结果表明各样地供试有瘤病害当归与无瘤健康当归的6种主要成分均存在差异。通甸镇供试有瘤病害当归样品与供试无瘤健康当归样品除绿原酸含量存在显著差异（P<0.05）外,其他5个成分的含量存在极显著差异（P<0.01）,且均以供试无瘤健康当归样品含量较供试有瘤病害当归样品含量高。立珠村供试有瘤病害当归样品与供试无瘤健康当归样品的6个成分的含量均存在极显著差异（P<0.01）,其中供试无瘤健康当归样品的洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯和丁烯基苯酞4个成分的含量较供试有瘤病害当归样品含量高,绿原酸和阿魏酸的含量却较其低。三裕村供试有瘤病害当归样品与供试无瘤健康当归样品6个成分的含量均存在极显著差异（P<0.01）,且以供试无瘤健康当归样品含量较供试有瘤病害当归样品含量高。立林村供试有瘤病害当归样品与供试无瘤健康当归样品除藁本内酯的含量没有差异外,其余5个成分的含量均存在显著差异（P<0.05）,以供试无瘤健康当归样品含量较供试有瘤病害当归样品含量高,表明立林村当归根癌病病害发生不严重。辘辘村供试有瘤病害当归样品与供试无瘤健康当归样品除丁烯基苯酞的含量存在显著差异（P<0.05）外其余5个成分的含量均存在极显著差异（P<0.01）。其中,供试无瘤健康当归样品绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H的含量较供试有瘤病害当归样品含量低;但是藁本内酯和丁烯基苯酞的含量却较其高。建立的HPLC指纹图谱结合含量测定、聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘方判别分析（OPLS-DA）可以客观、全面、有效地确定有瘤病害当归样品与无瘤健康当归样品中主要有效成分的差异,可为当归质量控制提供参考依据。4.运用药敏纸片法对所筛选的3%中生菌素WP、50%氯溴异氰尿酸WP、80%乙蒜素EC、20%松脂酸铜EW、20%噻菌酮SC和3%甲霜恶霉灵AS 6种低毒高效的杀菌剂进行室内毒力测定,结果表明3%中生菌素WP对根癌土壤杆菌的抑制效果最好,80%乙蒜素EC和50%氯溴异氰尿酸WP的抑菌作用次之,EC值分别为111.61 g/L、1180.88g/L和4427.96 g/L。5.根据室内毒力测定的结果筛选1×10～6cfu/m L根癌宁K84菌剂DP和10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP生物菌剂,3%中生菌素WP、80%乙蒜素EC和22%春雷·氯尿WP杀菌剂以及25%氯氟·噻虫胺SC杀虫剂,采用蘸根[根癌宁（0.7 g/L）、中生菌素（2.0 g/L）、乙蒜素（0.5 m L/L）、春雷·氯尿（2.0 g/L）]与拌毒土[枯草芽孢杆菌（4669.0 g/667 m）和氯氟·噻虫胺（150 g/667 m）]的施药方式,对当归根癌病进行田间药剂防治。结果表明,5种药剂的田间防治效果达到显著性差异水平,22%春雷·氯尿WP对根癌土壤杆菌的防效为42.27%,防治效果最好;其次为10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP,防效为36.52%;再次为80%乙蒜素EC,防效为34.57%。80%乙蒜EC处理的当归产量最高,为402.33 g/20株,具有显著的增产作用,增产幅度达到48.55%;10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP处理的当归产量为330.67 g/20株,较对照增产37.4%,增产作用较为显著。综上,推荐10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP为生产上防治当归根癌病的首选药剂,80%乙蒜EC为备选药剂。