文献类型：学位论文

中文题名：新型黄芩素类似物的设计、合成及生物活性研究

作者：夏鹏飞[1];

第一作者：夏鹏飞

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：赵磊;甘肃中医药大学|张建;甘肃中医药大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：黄芩;黄芩素;生物合成途径;生物活性

年份：2022

摘要：研究目的:黄芩是常用传统中药,具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性。黄芩苷、黄芩素是黄芩的主要药效成分,倍受关注。近年来研究表明黄芩中黄酮类成分生物合成途径中的查尔酮、甲氧基黄酮等关键前体化合物同样具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性。因此,研究生物合成途径中的前体化合物和终产物的生物活性具有同等重要的意义,也可为黄芩中先导化合物的发现提供一种新途径。基于以上思路,本论文基于生物合成途径中的关键前体化合物和终产物的骨架结构,运用药效团拼合原理,在其结构中引入具有抑制微管蛋白聚合活性的三甲氧基苯基药效团,设计、合成查尔酮、甲氧基黄酮及黄芩素类似物,并系统研究所合成化合物的生物活性,为基于黄芩素先导化合物的发现提供新的思路。研究方法:1.基于黄芩的药理活性以及目标化合物的骨架结构,结合蛋白数据库及Schr（?）dinger分子对接软件Glide模块的标准精度算法得到目标化合物-相关靶点的对接得分值,预测其结合稳定性;采用分子模拟的Pymol可视化软件得到目标化合物-相关靶点对接图,分析其相互作用,预测目标化合物的作用位点及结合方式。2.以3,4,5-三甲氧基苯酚为原料,经酯化反应及Fries重排合成得到中间体化合物2,3,4-三甲氧基-6-羟基苯乙酮,与不同取代基的苯甲醛经羟醛缩合反应得到目标化合物及其类似物（1）:2'-羟基-4',5',6'-三甲氧基查尔酮类似物（TMCs）,然后经环合反应得到目标化合物及其类似物（2）:5,6,7-三甲氧基黄酮类似物（TMFs）,最后经脱甲基反应得到目标化合物及其类似物（3）:5,6,7-三羟基黄酮类似物（THFs）。3.采用MTT法测定目标化合物及其类似物对人宫颈癌细胞（He La）、人胃癌细胞（MGC-803）、人结肠癌细胞（HCT-116）的抗增殖活性以及对人正常肝细胞（L02）的细胞毒性,筛选出具有良好抗增殖活性的化合物3c,对MGC-803的抗增殖活性及作用机制开展了进一步研究。同时,采用细胞集落实验和划痕实验测定3c对MGC-803细胞体外独立生存能力和迁移能力的影响;采用流式细胞术测定3c对MGC-803细胞周期的影响;进一步通过分子对接模拟实验分析3c与微管蛋白的结合情况。4.采用CCK-8法测定目标化合物及其类似物对小鼠巨噬细胞RAW 264.7增殖活性的影响,确定安全给药浓度;考察了不同浓度脂多糖对RAW 264.7细胞的影响,对炎症模型进行优化;采用Griess试剂法检测目标化合物及其类似物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞分泌细胞毒性分子NO的抑制作用,筛选出具有良好抗炎活性的化合物4v;进一步通过分子对接模拟实验分析化合物4v与iNOS的结合情况。5.采用平板打孔法测定目标化合物及其类似物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性。研究结果:1.分子对接结果表明,目标化合物骨架结构均可作用于微管蛋白的秋水仙碱结合位点,其中TMCs骨架结构与微管蛋白通过形成较强的疏水作用力,结合最为稳定,结合位点位于微管蛋白VAL238、ALA250、MET259、ALA316、ALA317、VAL315等氨基酸残基组成的疏水口袋中,并且空间口袋较大。目标化合物THFs骨架结构与iNOS能够形成较强的疏水作用力,结合最为稳定,其结构中吡喃酮的苯环与iNOS结构中的氨基酸残基ARG381形成了П-П堆积作用,同时其A环上7位的羟基与氨基酸残基VAL465形成了较强的氢键作用力,使THFs与iNOS能够稳定结合。2.合成得到51个目标化合物及其类似物,其中包括21个TMCs,20个TMFs,7个THFs,采用HR-MS,1H NMR,13C NMR等现代波谱技术表征了其结构,所得目标化合物及其类似物与黄芩黄酮类成分生物合成途径中的关键前体化合物结构类似且含有不同类型的取代基。3.MTT实验结果表明,加药浓度为100μM时,多数目标化合物显现出一定的抗增殖活性。TMCs及TMFs普遍具有相对较好的抗增殖活性,THFs抗增殖活性较弱。整体而言,对MGC-803及HCT-116细胞具有较好的选择性。TMCs整体具有较强的抗增殖活性(IC50<100),与分子对接模拟实验预测结果一致。其中化合物3c,即2,6-二氯-2'-羟基-4',5',6'-三甲氧基查尔酮,对MGC-803细胞表现出显著的抗增殖活性,IC50值为1.15±0.11μM,较阳性药cis-platin具有更好的抗增殖活性(IC50值为1.3±0.17μM),并且化合物3c对MGC-803细胞的抗增殖活性约是其对于人正常肝细胞L02细胞毒性的12倍;化合物3x,即3-三氟甲基-2'-羟基-4',5',6'-三甲氧基查尔酮,对HCT-116细胞具有显著的抗增殖活性,IC50值为3.55±0.63μM,较阳性药CA-4具有更好的抗增殖活性(IC50值为3.63±0.28μM),并且化合物3x对HCT-116细胞的抗增殖活性约是其对于人正常肝细胞L02细胞毒性的7倍。细胞集落实验结果显示化合物3c加药浓度为2μM时,结晶紫染色面积几乎完全消失。划痕实验结果显示随着化合物3c给药浓度的增加,细胞迁移率逐渐降低。细胞周期实验结果表明化合物3c能够阻滞MGC-803细胞周期于G2/M期;分子对接模拟分析结果显示化合物3c与微管蛋白主要是疏水相互作用,作用位点处于由微管蛋白MET259、ALA316、ILE378、VAL238、CYS241、LEU248、ASN258等氨基酸残基组成的疏水口袋中。4.CCK-8实验结果表明,TMCs对RAW 264.7细胞具有较强的抗增殖活性,在较低浓度时即表现出较强的细胞毒性。在安全浓度下,多数TMFs及THFs能够较好的抑制脂多糖诱导的巨噬细胞分泌NO,与分子对接模拟实验预测结果基本一致。其中化合物4v能够显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞分泌NO,IC50值为9.53±0.76μM,较阳性药塞来昔布具有更好的抑制率(IC50值为10.38±0.25μM)。分子对接模拟分析结果显示化合物4v与诱导型一氧化氮合酶主要形成了疏水相互作用,作用位点主要处在由PRO466、ILE462、MET120、TRP90、ARG381、GLU377、MET374等氨基酸残基组成的疏水口袋中。5.平板打孔实验结果表明,THFs对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌具有一定的抑制作用,但抑菌活性与阳性对照庆大霉素存在差距。TMCs及TMFs抑菌圈较小,抑菌活性一般。研究结论:1.通过分子对接模拟实验预测出TMCs主要作用于微管蛋白秋水仙碱结合位点,THFs主要作用于诱导型一氧化氮合酶结合位点,为后期化合物的设计、合成及生物活性研究提供了一定的理论依据。2.TMCs对MGC-803细胞具有更为显著的抗增殖活性。TMCs结构中B环存在吸电子基团（-Cl、-CF3）有助于增强其抗肿瘤活性,其中化合物3c的B环2'、6'位存在（-Cl）取代基,抗增殖活性优于阳性对照药顺铂,能够剂量依赖性的抑制MGC-803细胞的迁移及修复能力,阻滞MGC-803细胞周期于G2/M期,分子对接模拟实验结果显示化合物3c通过阻碍细胞微管蛋白自组装过程,破坏肿瘤细胞正常的微管网状形态分布,抑制肿瘤细胞增殖,并且对人正常肝细胞L02具有一定的选择性,推测其为一种潜在的微管蛋白抑制剂。THFs与TMFs骨架结构具有相近的抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌NO的作用。在TMFs的B环引入吸电子基团有助于增强其抗炎活性,其中化合物4v的抗炎活性最为显著,其B环为噻吩环,4'位存在（-Br）取代基,能够通过与iNOS稳定结合,抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌NO,推测其为一种潜在的抗炎先导化合物。3.基于黄芩中黄酮类成分的生物合成途径设计、合成目标化合物结合活性评价是发现先导化合物的一种有效方法,本研究筛选出的具有显著抗肿瘤、抗炎活性的先导化合物为后期黄芩素类化合物的进一步研究提供了科学依据。