文献类型：学位论文

中文题名：LOX-1敲减对2型糖尿病小鼠视网膜病变及TPL2的影响研究

作者：汪霞[1];

第一作者：汪霞

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：刘静;甘肃中医药大学|张琦;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：糖尿病视网膜病变;凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1;肿瘤进展位点2;氧化应激;视网膜炎症

年份：2023

摘要：目的:运用基因重组技术构建腺相关病毒载体(Adeno-associated virus vector,AAV)介导的短发夹RNA(Short-hairpin RNA,shRNA)敲减db/db小鼠视网膜组织凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1),研究LOX-1在糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)中的作用及对肿瘤进展位点2(Tumor progression locus 2,TPL2)的影响。方法:构建U6-MCS-CAG-EGFP(shRNA-LOX-1)以及pAAV-U6-shRNA-CMV b Globin-e GFP-3Flag(shRNA-Con)病毒。雄性db/m小鼠(7～8周龄,10只)为正常对照,记为(NC)组。相同周龄雄性db/db小鼠(30只)随机分为3组,每组10只。第1组给予生理盐水治疗,记为(NS)组;第2组注射腺相关对照病毒(shRNACon),记为(shRNA-Con)组;第3组注射腺相关LOX-1敲减病毒(shRNA-LOX-1),记为(shRNA-LOX-1)组。病毒转染期间,每周监测实验动物的体重和空腹血糖(FBG)。待小鼠病毒转染14周后,进行实验动物的处死与取材,之后进行相关实验。免疫荧光(IF)观察shRNA-LOX-1与shRNA-Con两组小鼠眼球石蜡切片视网膜组织病毒转染情况。眼底荧光血管造影(FFA)和苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜血管和病理变化。实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和蛋白质印迹(WB)检测视网膜组织凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)、肿瘤进展位点2(TPL2)和磷酸化肿瘤进展位点2(p-TPL2)的表达。小鼠眼球血行酶联免疫吸附试验(ELISA/ELASA)检测血管内皮生长因子(VEGF)、Nε-羧甲基赖氨酸(CML)和色素上皮衍生因子(PEDF)的水平。结果:1.3组db/db小鼠的体重和空腹血糖(FBG)均明显高于NC组小鼠(P<0.05),且3组db/db小鼠的FBG在8周龄时都超过了16.7mmol/L,并维持在较为稳定的状态。2.免疫荧光显示,腺相关LOX-1敲减病毒(shRNA-LOX-1)和腺相关对照病毒(shRNA-Con)成功转染到两组小鼠视网膜组织中。3.与NC组相比,NS组和shRNA-Con组小鼠视网膜LOX-1 mRNA及蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)。腺相关LOX-1敲减病毒(shRNA-LOX-1)转染后,shRNA-LOX-1组小鼠视网膜组织LOX-1在mRNA及蛋白表达水平上均显著降低(P<0.05)。4.眼底荧光血管造影(FFA)显示,与NC组相比,NS组和shRNA-Con组视网膜血管可见微小血管形态迂曲,有多处较明显的强荧光区域;而shRNA-LOX-1组小鼠视网膜血管走形接近NC组,未见视网膜微小血管形态迂曲及明显的强荧光。5.与NC组相比,NS组和shRNA-Con组HE染色表现为视网膜水肿,内、外核层细胞间水肿,各层细胞密度明显减少,排列紊乱,可见新生血管形成;而shRNALOX-1组表现接近NC组,视网膜各层细胞排列较规则、紧密,外核层细胞间稍疏松,未见新生血管形成。6.与NC组小鼠相比,3组db/db小鼠视网膜IL-1βmRNA和IL-6 mRNA水平均显著升高(P<0.05)。但敲减LOX-1可以显著下调IL-1βmRNA和IL-6 mRNA在db/db小鼠视网膜的表达(P<0.05)。7.与NC组小鼠相比,3组db/db小鼠视网膜TPL2 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。但敲减LOX-1后,shRNA-LOX-1组TPL2 mRNA及蛋白的表达在db/db小鼠视网膜显著上调(P<0.05)。8.与NC组小鼠相比,3组db/db小鼠视网膜TPL2蛋白总的表达水平无显著差异(P>0.05),但NS组和shRNA-Con组小鼠的p-TPL2(Ser400)较NC组显著增加(P<0.05),且p-TPL2在总TPL2蛋白的占比也显著增加(P<0.05),而在shRNALOX-1组中,p-TPL2的增加被显著抑制(P<0.05),p-TPL2在总TPL2的比例也显著下调(P<0.05)。9.与NC组相比,NS组和shRNA-Con组小鼠血清VEGF和CML含量均显著增加(P<0.05),PEDF含量均显著降低(P<0.05)。而在shRNA-LOX-1组中,VEGF和CML含量的增加被显著抑制(P<0.05),PEDF含量被显著上调(P<0.05)。结论:LOX-1参与调控了db/db小鼠视网膜损伤和TPL2的表达。LOX-1敲减可抑制视网膜血管生成、炎症与氧化应激以及TPL2磷酸化,从而延缓糖尿病相关视网膜病变的进展,对db/db小鼠视网膜损伤有保护作用。