文献类型：学位论文

中文题名：红景天苷对缺氧小鼠GC-1细胞氧化应激损伤的保护作用机制研究

作者：宋诚[1];

第一作者：宋诚

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：王玲;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：红景天苷;缺氧;GC-1细胞;氧化应激;线粒体信号通路;凋亡

年份：2023

摘要：目的:以小鼠精原细胞系GC-1细胞为研究对象,通过构建体外GC-1细胞氧化应激损伤模型,探讨红景天苷（Salidroside,SAL）对缺氧GC-1细胞的保护作用及发生机制。方法:1.通过模拟低氧条件处理GC-1细胞,观察缺氧对GC-1细胞的影响,采用CCK-8法、Hoechst 33342染色法筛选最佳造模时间;2.观察在模拟缺氧条件下GC-1细胞中线粒体信号通路的表达情况。设置对照组、实验组,检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、总抗氧化能力（total anti-oxidant capacity,T-AOC）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase,SOD）在缺氧GC-1细胞中的变化,以及线粒体膜电位、线粒体染色、线粒体ATP（adenosine triphosphate）含量和检测半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（Cystein-asparate protease-3,Caspase-3）、细胞色素C（Cytochrome C,Cyt-C）基因转录水平,以此探讨缺氧对GC-1细胞线粒体信号通路的影响;3.在模拟缺氧条件下采用不同浓度SAL（1、5、10、15、20μM）处理GC-1细胞,采用CCK-8法筛选出红景天苷低剂量组、中剂量组、高剂量组三个药物浓度。设置对照组、模型组、红景天苷实验组（SAL1μM组、SAL5μM组、SAL10μM组）,ROS、MDA、LDH、T-AOC、SOD的变化评价氧化应激水平,线粒体膜电位、线粒体染色、线粒体ATP评价线粒体功能,检测Caspase-3、Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,免疫荧光法检测Cleaved-Caspase-3表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。统计分析:实验结果采用SPSS 25.0软件进行统计分析,Graphpad Prism 9进行作图,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(（?）±S)表示,多组间比较采用One-Way-Anova分析,事后检验采用LSD检验,两组比较采用t检验,相关性分析采用斯皮尔曼（spearman）双变量相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.随着缺氧时间的延长,GC-1细胞凋亡数量逐渐增加,这与Hoechst33342染色结果一致。缺氧24 h（hour,h）细胞活力无明显变化（P>0.05）,缺氧30 h细胞活力下降（P<0.05）,缺氧36 h GC-1细胞活力进一步下降（P<0.01）,缺氧48 h细胞活力下降（P<0.001）,结果发现缺氧时间长度与GC-1细胞活力呈负相关（r=-0.857,P<0.001）;2.缺氧36 h,与对照组相比,实验组ROS、MDA、LDH水平升高（P<0.01）,T-AOC、SOD活力水平下降（P<0.01）。实验组线粒体膜电位下降、细胞内线粒体分布发生改变以及数量减少、ATP含量降低（P<0.01）;RT-PCR（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）结果显示:实验组Caspase-3、Cyt-C基因转录水平增高（P<0.01）;3.模拟缺氧条件下红景天苷对缺氧GC-1细胞的影响:与对照组相比,模型组细胞活力下降（P<0.001）,ROS、MDA、LDH水平升高（P<0.001）,T-AOC、SOD水平下降（P<0.001、P<0.001）;细胞膜电位水平下降,线粒体数量发生变化,荧光强度减弱（P<0.05）,ATP含量下降（P<0.01）,Caspase-3表达水平无明显变化（P>0.05）,Cleaved-Caspase-3、Cyt-C、Bax表达水平升高（P<0.001）,Bcl-2表达水平下降（P<0.001）;细胞凋亡率升高（P<0.001）;与模型组相比:实验组细胞活力升高（P<0.05）,SAL1μM组ROS水平差异无统计学意义（P>0.05）,SAL5μM组、SAL10μM组ROS水平下降（P<0.001）,三组MDA水平均下降（P<0.05）,SAL1μM组、SAL5μM组LDH水平下降（P<0.001）,SAL10μM组LDH水平变化差异无统计学意义（P>0.05）,SAL1μM组、SAL10μM组T-AOC水平变化差异无统计学意义（P>0.05）,SAL5μM组T-AOC水平升高（P<0.001）,三组SOD水平均升高（P<0.001）,SAL1μM组线粒体膜电位无明显变化,线粒体数量及荧光强度无统计学差异（P>0.05）,SAL5μM组、SAL10μM组线粒体膜电位有明显变化,线粒体数量增多、分布均匀荧光强度增加（P<0.05）,三组ATP含量升高（P<0.001）,三组Caspase-3表达水平差异无统计学意义（P>0.05）,三组Cleaved-Caspase-3、Cyt-C、Bax表达水平下降（P<0.05）,Bcl-2表达水平升高（P<0.05）,三组细胞凋亡率均下降（P<0.001）。结论:1.3%O、5%CO、92%N条件下缺氧36 h可成功构建GC-1细胞氧化应激损伤模型;2.缺氧可使GC-1细胞发生氧化应激反应,降低线粒体功能能并激活线粒体信号通路促进细胞凋亡;3.低剂量红景天苷对缓解缺氧GC-1细胞氧化应激损伤效果不明显;中、高剂量红景天苷均可不同程度缓解缺氧GC-1细胞中氧化应激水平,并通过下调线粒体信号通路减少缺氧GC-1细胞凋亡。