文献类型：学位论文

中文题名：当归阿魏酸对肝纤维化中肝星状细胞增殖的抑制作用及对JAK2、STAT3表达的影响

作者：孙墨晗[1];

第一作者：孙墨晗

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：陈光顺;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：肝纤维化;肝星状细胞;当归;阿魏酸;JAK2;STAT3

年份：2022

摘要：目的:基于网络药理学研究阿魏酸(Ferulic Acid,FA)对肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)疾病的作用机制,并根据结果建立大鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell-T6,HSC-T6)体外模型进行验证。探讨阿魏酸对肝纤维化中HSC-T6增殖与活化的影响,阐明FA可能通过下调Janus激酶2-信号转导子和转录激活子3(JAK2,STAT3)抗肝纤维化的作用机制及中药单体有效成分在体外实验的研究意义。方法:(1)通过有机小分子生物活性数据库(Pub Chem)、小分子药物靶点预测在线平台(Swiss Target Prediction)和药效预测靶点数据库(Pharm Mapper)筛选出FA的潜在靶点,与突变位点数据库(Dis Ge NET)、人类基因数据库(Gene Cards)和人类孟德尔遗传病数据库(OMIM)中筛选的FA靶点进行重合取交集,Cytoscape 3.7.2软件构建“阿魏酸-靶点-肝纤维化”网络图,随后利用STRING平台进行蛋白相互作用分析(Protein-Protein Interaction,PPI),采用R64 4.0.3对关键靶点进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。(2)基于此,体外培养HSC-T6,采用细胞活性检测(Cell Counting Kit-8,CCK-8),根据文献参考设置不同给药浓度以及给药时间12 h、24 h、48 h、72 h,筛选药物最佳有效浓度和干预时间,并确定实验分组,同时测定其对HSC-T6细胞增殖与活性的影响。(3)确定分组后,ELISA试剂盒检测各组细胞内HF的标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的含量表达,证明造模成功。(4)待细胞密度长满,通过划痕实验分别取不同时间给药后细胞生长情况的面积进行拍照,检测其迁移能力。(5)利用流式细胞仪检测HSC-T6给药后的周期情况,观察各组剂量的细胞周期阻滞变化。(6)利用流式细胞仪检测HSC-T6给药后的凋亡情况,观察各组剂量的细胞凋亡结果。(7)采用实时荧光定量(Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)分析HSC-T6中JAK2及STAT3 m RNA的相对表达水平。(8)采用蛋白质印迹(Western blot,WB)分析HSC-T6各组内JAK2蛋白及STAT3蛋白的表达水平,检验空白组与各给药剂量组之间蛋白表达区别。结果:(1)获得FA靶点334个,HF靶点数目为6324个,两者交集靶点254个,阿魏酸抗肝纤维化的核心靶点有胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、白蛋白(Albumin,ALB)、信号转导和转录激活因子3(Signal Transducer And Activvator Of Transcription3,STAT3)等,主要涉及炎性相关、肿瘤相关、癌症相关等信号通路发生作用。(2)CCK-8实验表明:与空白组相比,阿魏酸作用于HSC-T6细胞后,能够明显抑制其增殖与活性,阿魏酸浓度越高,其抑制能力越强。确定给药浓度100μg·m L、200μg·m L和400μg·m L作为阿魏酸低剂量组、阿魏酸中剂量组和阿魏酸高剂量组,阳性对照组给予秋水仙碱200μg·m L,最佳给药时间为48 h,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)ELISA实验表明:与空白组相比,阿魏酸低剂量组、中剂量、高剂量组与阳性对照组在处理HSC-T6后,能够显著下调HSC-T6细胞内α-SMA蛋白含量水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)划痕实验表明:与空白组相比,阿魏酸作用于HSC-T6时,其迁移抑制率较低,以高剂量组迁移能力最差,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)细胞周期实验表明:与空白组相比,阿魏酸低剂量组、中剂量组、高剂量组以及阳性对照组对HSC-T6细胞周期阻滞率明显增高,以高剂量组最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)细胞凋亡结果表明:与空白组相比,阿魏酸低剂量组、中剂量组、高剂量组以及阳性对照组能够加速HSC-T6凋亡,以高剂量组最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)WB与Q-PCR实验表明:与空白组相比,阿魏酸低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组均可下调JAK2和STAT3蛋白及m RNA的表达量,以高剂量组为甚,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)FA抗HF具有多通路、多靶点的特点。阿魏酸能够抑制HSC-T6的增殖,降低α-SMA蛋白的表达,提示阿魏酸抗肝纤维化的内在机制和抑制肝星状细胞有关。(2)阿魏酸能够抑制JAK2、STAT3的蛋白和m RNA表达,提示阿魏酸通过下调JAK2、STAT3继而抑制HSC-T6的活化与增殖。