文献类型：学位论文

中文题名：参苓白术散对脾虚证小鼠胃、小肠的保护作用和蛋白质双向电泳技术的建立

作者：雷英[1];

第一作者：雷英

机构：[1]甘肃中医学院;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：刘丽莎;甘肃中医学院

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：脾虚症;参苓白术散;脾脏;双向凝胶电泳;差异蛋白质

年份：2012

摘要：脾虚证反映了以消化系统功能障碍为主的全身性综合病理状态，是中医临床最为常见的病证，主要以益气健脾法治疗。临床与实验研究表明，小肠是脾虚证的主要部位,脾虚患者和脾虚动物都存在胃、小肠组织学形态和功能的病变，通过益气健脾方药治疗可得到明显改善。但国内对益气健脾中药治疗脾虚证作用机理的研究不多。参苓白术散是治疗脾虚证的经典方剂，有益气健脾，渗湿止泻之功效，目前关于参苓白术散治疗脾虚证的研究报道的很少。 [目的]本研究在中医药理论指导下，①观察参苓白术散对脾虚证小鼠血清胃泌素的含量及胃、小肠组织细胞形态变化、脾脏指数的影响；②建立小鼠的脾脏组织蛋白质双向凝胶电泳技术、分析电泳图谱，寻找参苓白术散治疗前后脾脏组织中差异表达蛋白质。观察参苓白术散益气健脾治疗脾虚证的功效，探讨其对脾虚证治疗可能的作用机理和物质基础。 [方法]①将小鼠随机分为4组：空白对照组、利血平模型组、参苓白术散低剂量组、参苓白术散高剂量组。观察各组小鼠的体征改变、测定血清淀粉酶和D-木糖的含量、放免法测定血清胃泌素含量；光镜及电镜下观察胃、小肠组织细胞形态变化；观察脾脏形态变化并测定脾脏指数。②标准裂解法收集脾脏总蛋白，丙酮沉淀法纯化蛋白。通过双向凝胶电泳技术获得标准裂解法和丙酮沉淀法纯化后所得蛋白的凝胶图谱，挑选获得蛋白浓度高以及图谱清晰的方法为最佳样品制备方法。③扫描凝胶成像，PDQUEST8.0图像分析软件进行分析比较，检测显著差异蛋白点。④挑选显著性差异表达的蛋白质点，利用基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-TOF-MS）对候选表达的差异蛋白做肽质量指纹(PMF)和MS质谱鉴定。 [结果] ①参苓白术散能够改善模型小鼠的体征、增加血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素的含量；使脾虚证小鼠胃和小肠病理改变得到很好的恢复；脾脏外观及脾脏指数基本接近空白对照组。②电泳图谱结果表明:PH3-10的17CM 胶条优于7CM胶条，可以使脾脏蛋白质得到充分的分离；丙酮沉淀法优于标准裂解法；优化传统聚焦条件后的使横向和纵向拖尾有明显改善，能获得分辨率较高的双向电泳图谱，所得图谱蛋白点更清晰，分离更完全。③双向凝胶电泳图谱经 PDQUEST8.0 软件检测分析蛋白点，获得各组的平均点数分别为空白对照组614±20、模型组687±25、低剂量组638±19、高剂量组643±17。经过进一步背景消减后将正常小鼠脾脏的一块胶定为参考胶与其它凝胶进行蛋白质点匹配，它和空白对照组、模型组、低剂量组、高剂量组的凝胶匹配百分率分别为90%、72%、82%、86%。斑点位置的重复性检测发现每组三块胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性。挑选出模型组与空白对照组差异明显蛋白质点8个, 其中在正常组表达上调的5个,表达下调的4个，挑选模型组和高剂量组差异明显蛋白质点14个，在高剂量组高表达的9个，低表达的5个，选取其中差异较为明显的5个蛋白点进行质谱鉴定。 [结论] ①参苓白术散能够通过改善模型小鼠的体征、增加血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素的含量、恢复脾虚证小鼠胃、小肠病理改变，达到治疗脾虚证的作用，并且其疗效与剂量呈相关性。②采用17CM胶条、丙酮沉淀法沉淀蛋白、使用改良后升压聚焦条件(17℃， 50V12H，250V1H，500V1H，4000V 线性升压4H，4000V聚焦20000VHR，500V保持任意时间)，可以获得较满意的小鼠脾脏组织蛋白质双向电泳图谱。③脾虚证小鼠电泳图谱中具有差异表达的蛋白质, 高剂量组的图谱和空白组匹配率高，这些蛋白质的变化可能与脾虚证的形成密切相关；也说明参苓白术散治疗脾虚证的机制之一可能是通过影响脾脏组织蛋白质的表达实现的。