文献类型：学位论文

中文题名：基因治疗制剂TPKH和TPIN的初步安全性评价及其免疫作用探讨

作者：李欣[1];

第一作者：李欣

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：哈小琴;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：基因治疗制剂;白细胞介素-2;肝细胞生长因子抑制剂;减毒沙门氏菌

年份：2020

摘要：目的：（1）通过BALB/c小鼠急性毒性实验、一般药理学实验、基因表达蛋白分布实验，Wistar大鼠长期毒性实验，初步评价携带KGF和HIF-1ɑ双基因的减毒沙门氏菌TPKH以及携带NK4和IL-2双基因的减毒沙门氏菌TPIN的安全性。　　（2）探讨携带双基因的减毒沙门氏菌TPKH及TPIN对小鼠细胞免疫和小肠黏膜免疫的影响。　　方法：（1）TPKH及TPIN小鼠急性毒性实验。不同剂量（1.0×108、1.0×109、1.0×1010cfu/0.1mL·只）TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠精神状态、体重的影响;灌胃后第14天进行血常规、肝功肾功指标及脏器指数的检测，并取对照组和高剂量灌胃组小鼠（1.0×1010cfu/0.1mL·只）心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织，制作病理切片，观察各脏器组织形态。　　（2）TPKH及TPIN一般药理学实验。不同剂量（1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/0.1mL·只）TPKH或TPIN灌胃后观察对小鼠一般行为、自发活动以及协调运动的影响。　　（3）TPKH及TPIN基因表达蛋白分布实验。对照组小鼠用0.1mL10%NaHCO3灌胃，实验组小鼠用1.0×1010cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃，分别于灌胃后0、12、24、48、72、96小时各取小鼠4只，取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、脑组织并制备成匀浆液，通过ELISA检测TPKH灌胃后各组织中KGF、HIF-1α蛋白以及TPIN灌胃后各组织中HGF（NK4为HGF的拮抗剂）、IL-2蛋白的表达水平。　　（4）TPKH及TPIN大鼠长期毒性实验。对照组用0.5mL10%NaHCO3灌胃，实验组不同剂量（1.0×107、1.0×1010cfu/0.5mL·只）TPKH或TPIN灌胃，每周灌胃2次，连续灌胃7周。分别于末次灌胃后的第1天、4周、8周、12周、16周各取大鼠4只进行血常规、血清生化指标、凝血四项、脏器指数的检测，并取末次灌胃后第12周对照组和高剂量灌胃组（1.0×1010cfu/0.5mL·只）大鼠心、肝、脾、肺、肾及胃肠组织，制作病理切片，观察各脏器组织形态，此外，取末次灌胃后的第1天对照组、第1天高剂量组、第4周高剂量组粪便标本进行16s rRNA测序。　　（5）TPKH及TPIN小鼠细胞免疫实验，对照组用0.1mL10%NaHCO3灌胃，实验组分别用1.0×109cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃，每周灌胃2次，灌胃4周，于末次灌胃后1周，收集全血，用流式细胞仪检测抗凝全血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T水平;肠黏膜免疫实验中，对照组用0.1mL10%NaHCO3灌胃，实验组用1.0×109cfu/0.1mL·只TPKH或TPIN灌胃，共灌胃2次，间隔7天，于第二次灌胃后第14天取小鼠12只，取小肠派伊尔结（PP结）和肠系膜淋巴结，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测B细胞活化转录因子（GATA3、PAX5）的表达情况，第28天取小鼠12只，取小肠黏膜，用ELISA检测小肠黏膜中IgA表达量。　　结果：（1）急性毒性实验期间各组小鼠精神状态良好，体重差异不显著（P＞0.05），各组小鼠的血常规、肝功肾功指标及脏器指数差异均不显著（P＞0.05）;病理切片结果显示，高剂量组的心脏、肝脏等脏器组织均无病理性改变。　　（2）一般药理学实验结果显示，各剂量组TPKH或TPIN对小鼠一般行为均无明显影响，对小鼠自发活动、协调运动无明显影响（P＞0.05）。　　（3）基因表达蛋白分布实验中，ELISA结果显示，与对照组相比，TPKH在灌胃后12、24、48、72、96小时，KGF、HIF-1ɑ蛋白在胃肠组织中能够显著表达（P＜0.05或P＜0.01），TPIN在灌胃后12、24、48、72、96小时，HGF、IL-2蛋白在胃肠组织中能够显著表达（P＜0.05或P＜0.01），而在心脏、肝脏等其他组织中各目的蛋白的表达与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。　　（4）长期毒性实验中，末次灌胃后的观察期内，各组大鼠均无明显的中毒反应及死亡情况;各剂量组大鼠体重均正常增长，与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;各剂量组血常规、凝血四项、脏器指数与对照组相比，差异均不显著（P＞0.05），血清生化指标除末次灌胃后的第1天ALP检测值与对照组比较有差异（P＜0.05或P＜0.01）外，其余检测指标各剂量组与对照组相比，差异均不显著（P＞0.05）;末次灌胃后第12周病理切片结果显示，与对照组相比，高剂量组心脏、肝脏等脏器组织均无明显的病理性改变;还发现TPKH灌胃后，能提高肠道益生菌的丰度，对肠道菌群产生有利的影响，TPIN灌胃后，对肠道菌群有一定的影响，但随着时间延长，影响均逐渐减弱。　　（5）细胞免疫实验中，流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，TPKH、TPIN灌胃组均可促进CD3+T、CD3+CD4+T细胞的活化增殖（P＜0.05或P＜0.01），提高CD3+CD4+/CD3+CD8+比值（P＜0.05）;肠黏膜免疫实验中，qRT-PCR结果显示TPKH或TPIN灌胃后均能够促进GATA3及PAX5的表达（P＜0.05或P＜0.01），ELISA结果显示与对照组相比，TPKH、TPIN灌胃组小肠黏膜IgA表达量显著增加（P＜0.01）。　　结论：（1）初步观察到TPKH及TPIN在动物实验中是安全的，未发现有明显毒性作用。　　（2）TPKH及TPIN能够促进小鼠细胞免疫，还可以增强小鼠的小肠黏膜免疫。