文献类型：学位论文

中文题名：红景天苷诱导HepG2、97H细胞凋亡和自噬的机制研究

作者：蒋兵[1];

第一作者：蒋兵

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：苏海翔;甘肃中医药大学|王涛;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：肝癌;红景天苷;凋亡;自噬;PI3K/Akt/mTOR

年份：2022

摘要：目的:探讨红景天苷诱导人源性肝癌细胞株HepG2、97H细胞凋亡和自噬的机制。 方法:本研究以人源性肝癌细胞株（HepG2、97H）和人肝正常细胞株（Hl7702）作为研究对象,以红景天苷作为研究药物,以自噬诱导剂雷帕霉素作为自噬研究的阳性对照,以自噬抑制剂二磷酸氯喹作为自噬研究的反向验证药物。前期先用网络药理学技术筛选红景天苷作用于HepG2、97H细胞的靶点及信号通路。 1.凋亡研究:用CCK-8法及多功能细胞分析仪检测各株细胞的生长曲线和红景天苷对HepG2、97H细胞增殖的影响。为评估红景天苷的安全性,用CCK-8法检测红景天苷对Hl7702细胞生长的影响。用划痕实验、Transwell小室实验检测红景天苷对HepG2、97H细胞侵袭迁移的影响。用倒置显微镜观察红景天苷对HepG2、97H细胞形态的影响。用透射电镜观察红景天苷对HepG2、97H细胞中线粒体膜的影响。用HE染色、Hoechst33342染色、AO/EB双染及流式细胞术检测红景天苷对HepG2、97H细胞周期及凋亡的影响。为观察自噬对细胞凋亡的影响,用倒置显微镜观察红景天苷联合二磷酸氯喹对HepG2、97H细胞形态的影响;用CCK-8法、平板克隆形成实验检测红景天苷联合二磷酸氯喹对HepG2、97H细胞增殖的影响;用HE染色、Hoechst33342染色及AO/EB双染检测红景天苷联合二磷酸氯喹对HepG2、97H细胞凋亡的影响。 2.自噬研究:用透射电镜观察自噬现象;用自噬特异性标志物MDC染色及AO染色检测红景天苷、雷帕霉素以及红景天苷联合二磷酸氯喹对HepG2、97H细胞自噬的影响。 3.机制研究:用Real-time PCR检测药物对HepG2、97H细胞中编码凋亡诱导蛋白Caspase-3基因、编码自噬诱导蛋白Beclin-1基因及编码自噬抑制蛋白p62基因的mRNA表达的影响;用Western blot法检测药物对HepG2、97H细胞中增殖相关蛋白C-myc,侵袭迁移相关蛋白E-cad、N-cad和Girdin,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9,自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1和p62,以及PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响。 结果: 1.用网络药理学筛选出红景天苷可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路作用于肝癌,且与该通路上的Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、LC3B、Beclin-1、p62等靶点密切相关。 2.HepG2和97H细胞均在24 h和72 h处生长缓慢,而在48 h处生长迅速,可作为后续给药处理时间的依据。 3.用2.5、5、10、20、40和80μM红景天苷分别作用于HepG2和97H细胞,24、48、72 h的IC50值分别为70.9μM、30.5μM、17.9μM和119.2μM、29.1μM、14.1μM。红景天苷对HepG2和97H细胞的生长具有抑制作用（P值均小于0.05）,而对Hl7702细胞的生长无明显的抑制作用（P>0.05）。 4.用不同浓度的红景天苷分别处理HepG2和97H细胞48 h后,与空白组相比,红景天苷对HepG2和97H细胞的增殖、迁移、侵袭均有一定的抑制作用,且红景天苷处理组中的C-myc、N-cad、Girdin蛋白水平均降低（P<0.05）,E-cad蛋白水平升高（P<0.05）。 5.用20、40和80μM红景天苷分别处理HepG2和97H细胞48 h后,与空白组相比,红景天苷处理组可诱导HepG2和97H细胞凋亡（P<0.05）,总凋亡率分别为（8.48±0.27）%、（16.48±0.15）%、（33.07±0.32）%（HepG2细胞）和（19.27±0.23）%、（27.55±0.51）%、（34.85±0.35）%（97H细胞）;阻滞HepG2细胞于G2/M期（P<0.05）,阻滞97H细胞于S期（P<0.05）。红景天苷处理组中编码凋亡诱导蛋白的Caspase-3基因的mRNA水平升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05）,Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白水平升高（P<0.05）。 6.用20、40和80μM红景天苷分别处理HepG2和97H细胞48 h后,与空白组相比,红景天苷可诱导HepG2和97H细胞自噬,且红景天苷处理组中编码自噬抑制蛋白的p62基因的mRNA水平降低（P<0.05）,编码自噬诱导蛋白的Beclin-1基因的mRNA水平升高（P<0.05）,p62蛋白水平降低（P<0.05）,自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1水平升高（P<0.05）。 7.用20、40和80μM红景天苷分别处理HepG2和97H细胞48 h后,与空白组相比,PI3K/Akt/mTOR信号通路上的PI3K、Akt和mTOR蛋白的表达水平没有显著变化（P>0.05）;而p-PI3K、p-AKt和p-mTOR蛋白表达水平呈显著性降低（P<0.05）。 8.用80μM红景天苷及联合二磷酸氯喹（5、10和20μM）分别处理HepG2和97H细胞48 h后,与80μM红景天苷处理组相比,联用组抑制细胞增殖及诱导凋亡的能力更强,且Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的促进作用更强（P<0.05）。与80μM红景天苷处理组相比,联用组中自噬活性降低,且p62蛋白水平升高（P<0.05）,自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1水平降低（P<0.05）。 结论: 1.红景天苷可抑制HepG2和97H细胞的生长,但对人正常肝细胞株Hl7702的生长没有明显的抑制作用。其机制可能与红景天苷可有效阻滞HepG2和97细胞的有丝分裂相关,红景天苷可阻滞HepG2细胞于G2/M期,阻滞97H细胞于S期。 2.红景天苷可抑制HepG2和97H细胞的增殖、迁移、侵袭,其机制可能与抑制增殖相关蛋白C-myc、侵袭迁移相关蛋白N-cad和Girdin的表达,并促进侵袭迁移相关蛋白E-cad的表达相关。 3.红景天苷可诱导HepG2和97H细胞凋亡,其机制可能与促进Caspase-3mRNA的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达相关。红景天苷还可诱导HepG2和97H细胞自噬,其机制可能与抑制p62mRNA的表达,促进Beclin-1 mRNA的表达,抑制p62蛋白的表达,促进LC3-II/LC3-I、Beclin-1蛋白的表达相关。 4.红景天苷可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活来调控HepG2和97H细胞凋亡和自噬。 5.红景天苷与自噬抑制剂二磷酸氯喹联合后,不仅可以降低红景天苷对HepG2和97H细胞的自噬活性,还进一步促进红景天苷对HepG2和97H细胞的凋亡,表明抑制自噬可增强红景天苷对HepG2和97H细胞的凋亡诱导作用,而红景天苷所诱导的自噬对细胞本身具有保护作用。 总之,红景天苷不仅能够通过抑制C-myc、N-cad、Girdin蛋白的表达,促进E-cad蛋白的表达来抑制HepG2和97H细胞的增殖、侵袭迁移,还能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中的Bcl-2、p62和LC3-I信号分子以及激活该通路中的Bax、Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1和LC3-II信号分子来诱导HepG2和97H细胞的凋亡和自噬。红景天苷与自噬抑制剂二磷酸氯喹的联合应用证实了抑制HepG2和97H细胞的自噬活性可明显增强红景天苷对肝癌细胞的杀伤效应,而红景天苷所诱导的自噬可作为一种保护性的机制来削弱红景天苷对肝癌细胞的凋亡诱导作用。