文献类型：学位论文

中文题名：基于miRNA探讨右归丸对激素抵抗型肾病综合征大鼠的增敏作用及机制研究

作者：王新斌[1];

第一作者：王新斌

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：戴恩来;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：肾病综合征;激素抵抗;右归丸;实验药理;miRNA

年份：2020

摘要：目的：　　激素抵抗型肾病综合征(SRNS)致病因素复杂，临床治疗较为棘手，疗效不尽如人意，随着病情的变化，常易发展为终末期肾病而危及患者的生命。足细胞损伤与慢性肾病发生、发展密切关联，足细胞相关蛋白、基因突变及表达异常是SRNS发生的关键环节。有研究表明，miRNA表达失调与肾病有关，成熟的Dicer酶可以通过一些非编码的微小RNA来介导调节SD分子的应答。故调控Dicer-miRNA通路，使SD分子的表达得以改善，减少蛋白尿。右归丸可通过减毒增敏来减缓SRNS肾病足细胞的损伤，发挥减少尿蛋白和保护肾脏的作用，其分子机制尚未完全阐明。　　方法：　　1.64只雄性SPF级Wistar大鼠适应性饲养1周，按体重随机分为空白组（Control，12只）和造模组（52只）。造模成功后随机分为模型组（Model）;泼尼松组（PAT）;泼尼松+右归丸高、中、低组（PAT+YGh、PAT+YGm、PAT+YGl）。一次性尾静脉注射阿霉素6mg/kg（10mg/支，用0.9%氯化钠溶液2ml稀释成浓度为5mg/ml），同时给予臀部肌肉注射氢化可的松25mg/kg/d（50mg/支，用0.9%氯化钠2ml溶液稀释成浓度为25mg/ml），2周，复制阿霉素肾病肾阳虚证模型。空白组大鼠左右后肢交替肌注等剂量生理盐水。　　2.各组大鼠成功造模2周后，固定时间灌胃，持续6周。分别于造模前、造模后14天、药物干预后14、28、42天代谢笼收集各实验大鼠24小时尿液标本，记录尿量。实验第55天晚上8点测定大鼠自主活动，开启自主活动仪测定5min的活动次数与抬头次数。第56天各组实验大鼠心脏采血，全自动生化分析仪检测血生化指标。　　3.实验第56天，局麻摘取双肾，将大鼠左侧肾脏切除取上下级分别加入4%戊二醛、4%多聚甲醛固定液固定组织，用于电镜、光镜、免疫荧光镜;右肾储存于-70℃冰箱，肾小球cRNA提取，用于基因芯片检测及RT-PCR相互验证。　　4.HE、PAS、PASM-Masson观察肾组织病理变化;免疫组化、western-blotting、real-time PCR等方法检测肾组织中dicer、nephrin、podocin、CD2AP、synaptopodin、Bax?Bcl-2?caspase-3蛋白及mRNA的表达。　　结果：　　1.大鼠一般状态造模后第7d大鼠腹腔中出现少量腹水，同时每日排出尿量减少，精神状态欠佳，食量减少，体重停止增长且下降。2周大鼠腹水明显增多，出现大量尿蛋白，且24h尿蛋白定量＞100mg/kg，同时大鼠出现嗜睡、反应迟钝，有弓背耸肩现象，蜷卧少动，体毛发灰发暗，大便稀溏等中医阳虚体征。提示SRNS模型大鼠复制成功。　　2.血肌酐、血尿素氮、总蛋白、白蛋白、24h尿蛋白、血脂检测结果各干预组均有不同程度的改善，右归丸中剂量组减少尿蛋白量、降低血脂疗效优于各干预组，各治疗组血肌酐、血尿素氮降低有统计学意义（p＜0.05）。　　3.肾小球病理形态改变光镜下空白组肾小球结构形态稳定;模型组肾小球略显肿胀，基底膜不规则增厚，系膜细胞轻度增生，肾小管内出现透明的管型;各治疗组肾小球病理形态的改变介于空白组与模型组之间。电镜下发现足细胞有足突融合、消失的改变，空白组足细胞未发现异常改变;且在电镜下，右归丸中剂量组对减轻足细胞融合，足细胞恢复效果明显。　　4.miRNA芯片分析结果模型组与空白组相比较，差异表达的miRNA23个，且高表达miRNA15个、低表达miRNA8个;与模型组比较，右归丸干预组中高表达的miRNA9个，低表达miRNA6个，其中SRNS肾病大鼠模型组织中rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P表达上调，rno-mir-205表达下调，经右归丸治疗后，上调的rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P得到抑制，而下调的rno-mir-205得到增强。通过real-time PCR对特异基因相互验证结果显示：模型组rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P与空白组rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P表达量比分别为1.94、2.53倍;rno-mir-205表达量其模型组与空白对照组的比值为0.28，所得结果与基因芯片接近，证实以上所筛选miRNA是SRNS最有代表性的miRNA。　　5.Dicer酶、SD蛋白分子的检测结果SRNS大鼠肾组织中Dicer酶免疫荧光强度、蛋白与mRNA表达均上调，而nephrin、podocin、CD2AP与synaptopodin结果相反，二者呈负相关。提示dicer酶通过Dicer-miRNA负向调控足细胞裂隙孔膜相关蛋白分子，同时骨架蛋白表达减少及足细胞的凋亡与miRNA有一定的相关性。　　6.右归丸干预后dicer、nephrin、podocin、CD2AP免疫荧光、蛋白与核酸的表达结果与模型组比较，右归丸组肾组织Dicer酶免疫荧光强度减弱，呈线状分布，核酸与蛋白表达下降，而SD相关分子免疫荧光表达增强，呈颗粒状分布，mRNA与蛋白表达量均升高。　　7.细胞凋亡相关因子免疫荧光、蛋白与mRNA的表达检测结果与空白组比较，模型组Bax、caspase-3免疫荧光强度均增强，蛋白及mRNA表达均升高（p＜0.05），而Bcl-2表达降低（p＜0.05），各干预组对Bax/Bcl-2、caspase-3表达水平均有改善，但右归丸干预各组Bax、caspase-3蛋白及mRNA表达下调，Bcl-2蛋白和mRNA表达明显上升（p＜0.01）。说明右归丸通过骨架蛋白及细胞凋亡因子发挥保护足细胞作用，这一作用与右归丸对类固醇激素的增敏作用有关。　　结论：　　1.本实验在复制激素抵抗型肾病综合征动物模型时采用“病证结合”的方式，即单次尾静脉注射阿霉素6mg/kg建立FSGS肾病模型，同时肌注氢化可的松25mg/kg，造成肾阳虚证，成功地模拟典型的SRNS临床病证，效果确切。　　2.基因芯片对SRNS大鼠肾组织中miRAN筛选显示，SRNS肾病大鼠皮质中23个miRNAs特异性表达，其中15个高表达，8个低表达，Fold Change从0.3到3.4。筛选出SRNS特征性miRNA:rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P的表达显著上调，提示这些miRNA可能参与足细胞损伤。rno-mir-205在激素抵抗型肾病综合征模型大鼠中低表达，提示miRNA可能通过抑制足细胞凋亡和增强激素对药物的敏感性而发挥作用。　　3.SRNS肾病大鼠足细胞裂孔隔膜分子及骨架蛋白的表达是通过Dicer酶介导miRNA负向来调控。足细胞的损伤及足细胞的凋亡还可能通过Dicer-miRNA来参与。提示Dicer-miRNA是防治SD蛋白分子与尿蛋白异常的靶向点。　　4.右归丸可下调激素抵抗型肾病综合征模型大鼠Dicer表达，同时右归丸对SRNS肾病大鼠足细胞裂孔隔膜分子nephrin、CD2AP、podocin及骨架蛋白synaptopodin表达的影响可能是通过Dicer-miRNA途径来调控。提示Dicer、rno-mir-29b-3P、rno-mir-26b-5P可能是右归丸治疗SRNS肾病，维护保护肾小球滤过屏障，保护足细胞，减少蛋白尿的靶点。　　5.右归丸可抑制SRNS大鼠肾组织中Bax升高，Bcl-2的下降，修复足细胞Bax/Bcl-2平衡态，降低凋亡标志性蛋白caspase-3活性，改善足突融合，从而维持足细胞数目的稳定，保护足细胞免于凋亡。　　6.右归丸各剂量组均可改善激素抵抗型肾病综合征蛋白尿、改变低蛋白血症、降低胆固醇和甘油三酯的水平，减轻足细胞足突融合、降低或减少细胞膜外基质积聚、肾小球系膜增生及肾小管上皮细胞变性等发挥减毒增敏作用。然右归丸中剂量组疗效显著。