文献类型：学位论文

中文题名：A组轮状病毒VP6蛋白抗体制备及血清抗体检测方法的建立

作者：苏韫曦[1];

第一作者：苏韫曦

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：郑贵森;甘肃中医药大学|段招军;甘肃中医药大学|孙晓曼;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：轮状病毒;VP6蛋白;抗体制备;抗体检测

年份：2022

摘要：目的:表达和纯化A组轮状病毒（Rotavirus,RV）VP6蛋白;利用纯化后的RV病毒粒子和VP6蛋白分别免疫动物制备特异性多克隆抗体;基于VP6蛋白建立血清中人A组轮状病毒抗体水平的检测方法。方法:（1）将VP6基因连接到p ET30a载体构建重组质粒,鉴定成功后在大肠杆菌系统中进行蛋白表达,22℃低温诱导表达和纯化可溶VP6蛋白,37℃高温诱导制备包涵体VP6蛋白并进行透析复性;（2）将VP6基因连接到p Fast Bac1载体构建重组质粒并在蛋白C端带有his标签,鉴定成功后利用杆状病毒表达系统制备VP6蛋白,使用亲和层析镍柱进行纯化;（3）培养和纯化完整RV病毒粒子,分别以RV和RV VP6蛋白为免疫原,免疫动物获得多克隆抗体,利用间接ELISA法检测制备抗体的效价;（4）以纯化得到的VP6蛋白为包被抗原,建立检测血清中人RV抗体的间接ELISA方法,优化条件后对46份湖南腹泻入院儿童血清样本进行RV抗体水平的检测。结果:（1）利用大肠杆菌表达系统得到包涵体VP6蛋白,包涵体透析复性后仅能得到少量可溶蛋白,复性效率低。利用杆状病毒表达系统表达得到纯度高、免疫原性好的可溶VP6蛋白;（2）利用纯化的RV病毒粒子免疫小鼠得到效价较高的RV鼠多抗,VP6包涵体蛋白免疫兔子制备RV VP6兔多抗,两种多抗均可用于Western Blotting检测,鼠多抗纯度较高且特异性更好;（3）利用建立的间接ELISA法检测46份腹泻儿童血清样本,血清稀释至1:6000后检出率为82.6%。结论:本研究成功表达纯化出A组轮状病毒VP6可溶蛋白,制备得到RV鼠多抗和RV VP6兔多抗,并基于VP6蛋白建立了间接ELISA法用以检测血清中人轮状病毒抗体水平,为轮状病毒检测及疫苗评价相关研究奠定了基础。