文献类型：科技成果

中文题名：外泌体在放射性心脏纤维化损伤中的作用初探及黄芪总皂苷的实验干预

完成人：顾静[1];李海龙[1];金戈[1];刘建鸿[1];董晓丽[1];杨玲玲[1];白彦丽[1];段依璠[1];

第一作者：顾静

完成机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

年份：2024

语种：中文

中文关键词：心脏纤维化损伤;黄芪总皂苷;分子生物学

摘要：1.课题来源与背景：1.1来源：甘肃省科学技术厅(自然科学基金，21JR1RA262)1.2背景：RIHD是严重的肿瘤放疗副反应，病理为纤维化，分子机制不清，缺乏有效防治手段。CFs在损伤刺激下分化为表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞，分泌胶原纤维(Col)、生长因子(如TGF-β)等，引起纤维化的发生发展;CFs等多种细胞应激时分泌的外泌体参与纤维化微环境的形成，调节器官纤维化，但未有研究外泌体在RIHD中的作用;该项目以“益气养阴”为原则，用补气中药黄芪有效成分AST干预放射性外泌体处理的CFs，探讨其药效和抗纤维化机制。2.研究目的与意义：该项目以“益气养阴”为原则，用补气中药黄芪有效成分 AST 干预放射性外泌体处理的心脏细胞。(1)明确 X 线照射心脏细胞产生的外泌体(放射性外泌体)对RIHD 纤维化病理过程的影响，从外泌体旁分泌效应影响纤维化微环境的角度入手探讨RIHD的病理机制;(2)基于上述外泌体相关的放射性心脏纤维化病理机制，观察中药黄芪有效成分 AST 干预 RIHD的药效，探讨其护心抗纤维化的药理作用。3.主要论点与论据：3.1外泌体鉴定：透射电镜下，负染的大多数外泌体显示为50-150nm杯状膜泡。NTA纳米粒子跟踪分析：对照组外泌体浓度为1.7x108exo/mL，平均粒径为75.28nm;照射组外泌体浓度为4.78×10⁷exo/mL，平均粒径为65.61nm。纳米流式细胞仪检测显示外泌体特征性标志蛋白CD9、CD63和CD81阳性。鉴定为外泌体。3.2流式细胞术检测CFs周期：与Control组相比，24h时，X-CFs组、X-exo+CFs组处于G0/G1期的细胞比例降低，S期、G2/M期的比例升高(均P<0.01)，48h时，X-CFs组、X-exo+CFs组处于G0/G1期的比例降低，处于S期比例增高(均P<0.01);与X-exo+CFs组相比，24h时，X-exo+AST-CFs组处于G0/G1期比例升高，S期、G2/M期比例降低(均P<0.01)，48h时，X-exo+AST-CFs组处于G0/G1期的比例升高，S期比例降低(P<0.01)、G2/M期的胞比例降低(P<0.05)。3.3划痕实验检测CFs迁移能力：和Control组相比，X-CFs组与X-exo+CFs组迁移率升高;与X-exo+CFs组相比，X-exo+AST-CFs组细胞迁移率降低(p<0.01)。3.4Western blot检测纤维化分子表达：与Control组相比，X-CFs组、X-exo+CFs组TGF-β1、ColⅠ表达增加;与X-exo+CFs组相比，X-exo+AST-CFs组TGF-β1、ColⅠ均降低(P<0.01)。3.5RNA-seq测序结果：Control和X-CFs中差异表达的外泌体miRNA共有28个(|log2FoldChange|>1，P<0.05)，其中上调的外泌体miRNA中|log2FC|>2的共8个，分别为：miR-483-5p、miR-212-3p、miR-1306-3p、miR-193a-3p、miR-709、miR-134-5p、miR-883-3p、miR-296-5p;表达下调的外泌体miRNA中|log2FC|>2的共12个，分别为：miR-216a-5p、miR-217-5p、miR-216b-5p、miR-9a-5p、miR-195-3p、miR-434-3p、miR-138-5p、miR-433-3p、miR-122-5p、miR-203a-3p、miR-499-5p、miR-205。外泌体miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、mTOR、ECM-receptorinteraction、cAMP、Wnt、TGF-β、Notch、Ras、Rap1、AMPK等相关通路引起RIHD心肌纤维化发生发展。3.6黄芪皂苷防护RIHD的机制可能与其通过调节外泌体miRNA作用于AKT1、FYN、IGF1R、MAP2K1、JAK3、PRKCD、PRKCQ、PTPN1等核心靶点有关，也与调控PI3K-Akt、Rap1、cAMP 、FoxO、TCR、AMPK、MAPK、cGMP-PKG等信号通路有关。4.创见与创新：4.1既往研究多围绕TGF-β活化调节展开，鲜有研究关注外泌体相关的放射性纤维化机制，该项目拟从细胞水平观察X线照射CFs产生的外泌体(放射性外泌体)对CFs的增殖、迁移、纤维化因子表达和向肌成纤维细胞转化的影响，并通过RNA-seq技术测序分析这种放射诱导的外泌体中RNA表达谱的变化，从外泌体旁分泌效应影响纤维化微环境的角度入手探讨RIHD病机，这具有鲜明的特色和创新性，也具有重要的科学价值和临床意义。4.2既往研究显示黄芪对放射性纤维化有效，但机制不清。该项目从放射性外泌体引起CFs促纤维化改变出发，探讨AST其护心抗纤维化的药理机制，是该项目的重要创新和特色之处。5.社会经济效益，存在的问题：5.1社会经济效益：该项目对中药及其有效成分在防护肿瘤放化疗副反应方面运用先进技术方法，多角度、多层次、多方面进行研究，以获得中药防护放射性心脏纤维化损伤的分子生物学认识。提高中药研究的科学性、系统性，以便更好地服务于临床，以体现社会效益。该研究以放射性外泌体共培养CFs，从外泌体介导辐射旁效应影响纤维化微环境的角度入手探讨RIHD的病理机制，为辐射旁效应促进放射性心脏纤维化的发生发展提供了实验依据;并基于此以“益气养阴”为原则，用补气中药黄芪有效成分AST干预放射性外泌体处理的CFs，探讨其护心抗纤维化的药理作用，以便更好地服务于临床。该研究成果的推广应用将为中药防护肿瘤放化疗副反应的同类研究以启迪。5.2存在问题：该实验通过RNA-seq技术测序分析放射诱导的外泌体中miRNA表达谱的变化，再结合生物信息学分析外泌体miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、cAMP、TGF-β等相关通路引起RIHD心肌纤维化的发生发展，但其作用机制还有待验证，后续将运用RT-PCR技术验证这些microRNA的表达并进行相关靶基因mRNA的检测。此外，结合网络药理学分析黄芪皂苷护心抗纤维化的作用机制可能与黄芪皂苷调节外泌体miRNA作用于其靶点并调控相关信号通路有关，也未进行验证。后续将运用分子对接技术模拟配体与靶点蛋白的结合情况，并运用miRNA转染及基因沉默技术调控miRNA相关信号通路分子表达，并通过观察相关生物效应的变化论证外泌体介导辐射旁效应的miRNA分子机制。