文献类型：学位论文

中文题名：鸦胆子素D对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭影响的研究

作者：赵玉[1];

第一作者：赵玉

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：龙凤;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：乳腺癌;鸦胆子素D;lncRNA KCNQ1OT1;迁移;侵袭

年份：2023

摘要：目的通过观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默的钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录物1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)并联合鸦胆子素D(Bruceine D,BD)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,探究BD通过调控lncRNA KCNQ1OT1抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭可能的分子机制,为以lncRNA KCNQ1OT1为靶点研发治疗乳腺癌的靶向药物及药物组合提供药理学依据,并奠定科学的理论基础。方法1.在线数据库分析lncRNA KCNQ1OT1在正常乳腺组织与乳腺癌组织中的差异表达,并评估lncRNA KCNQ1OT1的表达与乳腺癌患者生存期之间的相关性,通过实时荧光定量PCR检测人正常乳腺上皮MCF-10A细胞、人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞中lncRNA KCNQ1OT1的表达水平。2.CCK8实验和平板克隆实验检测不同浓度的BD对MDA-MB-231细胞的活力和克隆形成能力的影响;通过实时荧光定量PCR检测不同浓度的BD对MDA-MB-231、MCF-7细胞中lncRNA KCNQ1OT1表达的影响及siKCNQ1OT1转染MDA-MB-231细胞后lncRNA KCNQ1OT1的表达;CCK8法检测不同处理BD(0μg/mL)组、siNC组、siKCNQ1OT1组、BD(0.4μg/mL)组、siNC+BD(0.4μg/mL)以及siKCNQ1OT1+BD(0.4μg/mL)组对MDA-MB-231细胞活力的影响。3.划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测不同处理组BD(0μg/mL)组、siNC组、siKCNQ1OT1组、BD(0.4μg/mL)组、siNC+BD(0.4μg/mL)以及siKCNQ1OT1+BD(0.4μg/mL)组对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。4.蛋白免疫印迹(Western blot)检测BD(0μg/mL)组、siNC组、siKCNQ1OT1组、BD(0.4μg/mL)组、siNC+BD(0.4μg/mL)以及siKCNQ1OT1+BD(0.4μg/mL)组中MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白的表达情况。5.利用生物信息学分析lncRNA KCNQ1OT1的靶基因及其相关信号途径。6.Western blot检测BD(0μg/mL)组、siNC组、siKCNQ1OT1组、BD(0.4μg/mL)组、siNC+BD(0.4μg/mL)以及siKCNQ1OT1+BD(0.4μg/mL)组中MDA-MB-231细胞CDC42、p-MKK7、MKK7蛋白的表达情况。结果1.lncRNA KCNQ1OT1在乳腺癌组织及细胞系中表达上调且与乳腺癌患者生存期呈负相关。2.BD可呈浓度依赖性地抑制人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞活力,且BD对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用更为显著(P<0.01);BD能抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞中lncRNA KCNQ1OT1的表达,且MDA-MB-231细胞对BD更敏感(P<0.01);与siNC组相比,siKCNQ1OT1转染后MDA-MB-231细胞中lncRNA KCNQ1OT1的表达显著降低(P<0.01);与对照组相比,siKCNQ1OT1联合BD(0.4μg/mL)对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用比单独应用siKCNQ1OT1或BD(0.4μg/mL)更为显著(P<0.01)。3.与对照组相比,BD和siKCNQ1OT1能显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力,且二者联用时抑制作用更强(P<0.05或P<0.01)。4.与对照组相比,单独应用siKCNQ1OT1或BD(0.4μg/mL)均可下调MDA-MB-231细胞中N-cadherin和Vimentin的表达而上调E-cadherin的表达;但siKCNQ1OT1和BD(0.4μg/mL)联用时对MDA-MB-231细胞中N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表达调控作用更为显著(P<0.01)。5.在线数据库分析lncRNA KCNQ1OT1靶基因共939个,筛选出的靶点主要富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、转录调控,DNA模板和细胞迁移等关键生物过程,其信号通路主要富集在癌症、Hippo和MAPK信号通路。6.与对照组相比,BD(0.4μg/mL)和siKCNQ1OT1均分别能下调MDA-MB-231细胞中CDC42和p-MKK7的表达(P<0.01);当BD(0.4μg/mL)和siKCNQ1OT1联用时,MDA-MB-231细胞中CDC42和p-MKK7的表达量较单独应用BD(0.4μg/mL)或siKCNQ1OT1下调更为显著(P<0.05或P<0.01),而各处理组的MDA-MB-231细胞中MKK7的表达未见明显变化。结论1.BD联合siKCNQ1OT1可显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和EMT进程。2.BD下调lncRNA KCNQ1OT1抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制可能与阻断CDC42/MKK7信号通路有关。