文献类型：学位论文

中文题名：骨碎补干预骨髓间充质干细胞对兔关节软骨修复的实验研究

作者：许宏斌[1];

第一作者：许宏斌

机构：[1]甘肃中医学院;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：张晓刚;甘肃中医学院

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：BMSCS;诱导;骨碎补;PLGA;FN;组织工程

年份：2012

摘要：目的：1.骨碎补干预骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导。2. 观测兔软骨细胞-FN/PLGA/TGF-β1生物支架复合体对兔膝关节软骨缺损修复的实验研究。 方法：1.进行兔骨髓间充质干细胞的体外培养，通过形态学观察、FCM 检测及甲苯胺蓝染色进行鉴定；2. 最佳浓度骨碎补干预兔 BMSCS 向软骨细胞转化，通过 MTT法对细胞活性的检测、免疫组化对Ⅱ型胶原的测定及甲苯胺蓝染色检测GAG的合成等方法观察体外培养的兔BMSCS增殖分化的情况，并以此得到软骨细胞；3. 将聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)生物支架切成4MM*4MM*4MM大小，消毒，将诱导好的第2代软骨细胞以4×1010/L体外接种于PLGA生物支架上，体外培养7天，观察细胞在支架内的生长情况、形态及吸附、分布情况;行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察软骨细胞数量、形态及Ⅱ型胶原含量，并利用图像分析软件对Ⅱ型胶原免疫组化染色面积进行分析。4. 将细胞-支架复合物植入兔膝关节软骨缺损处，分别在4周，8周，12周取样，观察细胞-支架复合物对软骨缺损的修复情况。 结果：1.①兔BMSCS成均匀分布的簇状生长、形态梭形。在传代培养中形态特性无明显变化、均质性提高，高表达CD44，不表达CD34，可证明为非造血干细胞。②骨碎补可以诱导兔BMSCS向软骨细胞分化，诱导后的细胞能分泌细胞外基质，例如Ⅱ型胶原蛋白，用组织学检查及Ⅱ型胶原抗体免疫荧光检测证实骨髓间充质干细胞已转化为软骨细胞。2.①HE染色 对照组支架纤维组织有所增加，未见成软骨细胞和软骨组织，支架被少许骨基质及纤维组织填充;试验组支架降解成网状并被吸收，成软骨区圆形、椭圆形、多边形成软骨细胞及细胞间质逐渐增多，生成少量软骨组织，并见少量多核的破骨细胞及软骨基质；空白组仅见少量淋巴细胞和纤维细胞，未见软骨细胞。②Ⅱ型胶原染色 细胞支架组软骨区域PLGA生物支架逐渐降解减少，Ⅱ型胶原染色阳性逐渐增强，类软骨样组织逐渐增多，术后12周后可见少许类软骨样组织；对照组和空白组术后Ⅱ型胶原染色均为阴性；③甲苯胺蓝染色 细胞支架组术后4至8周甲苯胺蓝染色阳性逐渐增强，细胞核外类软骨样组织逐渐增多，术后12周有类软骨样组织生成；对照组和空白组各检测周期甲苯胺蓝染色阴性 3.电镜扫描 细胞支架组成软骨区可见大量圆形、椭圆形软骨细胞；对照组扫描电镜下表面较粗糙，孔隙较多，大小不一，孔隙间多有交通，未发现软骨细胞；空白组电镜下未发现软骨细胞生成。 结论：1.通过体外对兔BMSCS的分离培养与鉴定，可建立较完善的BMSCS培养体 系；骨碎补各组与阳性对照组相比诱导作用弱，但与空白组比较有阳性意义。2.纤维粘连蛋白修饰的PLGA支架具有良好的亲水性，更适合软骨细胞贴附生长以及Ⅱ型胶原的合成;3.软骨细胞-FN/PLGA/TGF-β1 复合体修复软骨缺损具有可行性，在软骨组织缺损修复中具有较大的应用前景。