文献类型：学位论文

中文题名：缺氧胃癌细胞来源的外泌体通过MEK-ERK信号通路诱导巨噬细胞极化促进肿瘤生长和转移的机制研究

作者：陈鑫[1];

第一作者：陈鑫

机构：[1]甘肃中医药大学;

第一机构：甘肃中医药大学

导师：李红玲;甘肃中医药大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：缺氧;胃癌;外泌体;巨噬细胞;MEK/ERK信号通路

年份：2023

摘要：目的:探讨两种不同人源性胃癌细胞株(MKN-45和AGS)来源的外泌体对巨噬细胞(RAW264.7)的作用,并对胃癌来源的外泌体促进巨噬细胞极化及胃癌细胞生长转移的可能机制提供实验依据。方法:1.应用生物信息学技术预测胃癌与巨噬细胞之间的共有潜在靶点及信号通路。2.从常氧型和缺氧型人源性胃癌细胞株(MKN-45和AGS)的上清培养液中提取外泌体。3.采用透射电镜、纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)技术、蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)等方法鉴定提取的胃癌源性外泌体。4.采用PKH26红色染料标记提取的胃癌源性外泌体,并用DAPI蓝色染料标记巨噬细胞核共培养后,通过倒置荧光显微镜观察外泌体的摄取结果。5.将提取的胃癌源性外泌体与巨噬细胞(RAW 264.7)共培养后,分别用平板克隆实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验检测胃癌源性外泌体对RAW 264.7细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。6.采用流式细胞术检测流式细胞术检测M2型巨噬细胞分子标志蛋白CD206表达和M1型巨噬细胞分子标志蛋白CD86表达。7.将提取的常氧型和缺氧型MKN-45细胞源性外泌体分别与两株人源性胃癌细胞(MKN-45和AGS)共培养后,采用细胞划痕实验观察常氧型和缺氧型MKN-45细胞源性外泌体对胃癌细胞生长和迁移的影响。8.采用WB技术检测胃癌源性外泌体对RAW 264.7细胞中MAPK(MEK/ERK)信号通路相关蛋白表达水平的影响。结果:1.胃癌与巨噬细胞之间共同富集到35个基因,并从中筛选出10个潜在分子,且胃癌可能通过MAPK(MEK/ERK)信号通路作用于巨噬细胞。2.两种胃癌细胞源性外泌体均可在常氧及缺氧条件下被顺利提取。透射电镜下检测外泌体形态呈典型杯状形态;NTA技术检测外泌体粒径大小在100-150 nm之间;WB技术检测外泌体特征性标记蛋白,均呈现阳性表达。这些结果表明通过差速离心法提取的物质为外泌体。3.常氧型及缺氧型胃癌细胞源性外泌体与巨噬细胞共培养后,通过外泌体的内化实验表明PKH-26标记的外泌体能够被RAW 264.7细胞摄取。4.与未加外泌体的空白对照组相比,加入胃癌源性外泌体的实验组对巨噬细胞(RAW 264.7)的增殖及侵袭能力均明显增强。与常氧型胃癌细胞源性外泌体相比,缺氧型胃癌细胞源性外泌体更容易促进RAW 264.7细胞增殖、迁移及侵袭。此外,无论是常氧还是缺氧环境下所孵育的胃癌细胞,加入MKN-45细胞源性外泌体的实验组较加入AGS细胞源性外泌体的实验组增殖、迁移及侵袭能力更强。5.与未加外泌体的空白对照组相比,加入胃癌源性外泌体的实验组对RAW 264.7细胞的极化能力均明显增强。与常氧型胃癌细胞源性外泌体相比,缺氧型胃癌细胞源性外泌体更容易促进RAW 264.7细胞发生极化。此外,无论是常氧还是缺氧环境下所孵育的胃癌细胞,加入MKN-45细胞源性外泌体的实验组较加入AGS细胞源性外泌体的实验组极化诱导能力更强。6.与常氧型MKN-45细胞源性外泌体相比,缺氧型MKN-45细胞源性外泌体更容易促进MKN-45和AGS细胞迁移,其细胞生长密度也随之增多。7.用提取的胃癌细胞源性外泌体和巨噬细胞(RAW 264.7)共培养后,MEK/ERK通路中的p-MEK、p-ERK、MEK和ERK蛋白的相对表达水平均呈上调趋势。与加入常氧型胃癌细胞源性外泌体的实验组相比,加入缺氧型胃癌细胞源性外泌体的实验组中p-MEK、p-ERK、MEK和ERK蛋白的相对表达水平更高。此外,无论是常氧还是缺氧环境下所孵育的胃癌细胞,加入MKN-45细胞源性外泌体的实验组较加入AGS细胞源性外泌体的实验组上调更多的p-MEK、p-ERK、MEK和ERK蛋白的相对表达量。结论:胃癌细胞源性外泌体能够促进巨噬细胞发生极化,从而增强巨噬细胞的增殖、迁移及侵袭能力,且缺氧型胃癌细胞源性外泌体比常氧型胃癌细胞源性外泌体更容易促进上述生物学作用,而加入MKN-45细胞源性外泌体的实验组较加入AGS细胞源性外泌体的实验组极化诱导能力更强。此外,胃癌细胞源性外泌体对胃癌细胞的生长及转移具有促进作用,这些现象可能与MEK/ERK信号通路的调控密切相关。